智利進口荷斯坦牛β-Lg和β-CN基因多態性及其對泌乳性能的影響

梁艷，倪煒，王夢琦，儲雙鳳，楊章平，毛永江

（揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009）

乳蛋白約占乳中干物質的90%，是乳中重要的營養物質和主要的含氮物質，主要包括乳清蛋白和酪蛋白兩大類。乳清蛋白包括α-乳白蛋白（α-La）、β-乳球蛋白（β-Lg）、血清蛋白和少量免疫球蛋白，其中β-乳球蛋白是乳清蛋白的主要成分。酪蛋白是乳中含量最高的蛋白質，包括αs1-酪蛋白（αs1-CN）、αs2-酪蛋白（αs2-CN）、β-酪蛋白（β-CN）、κ-酪蛋白（κ-CN）。Ashaffenburg等[1]研究證明β-乳球蛋白基因存在多態性，其多態性與泌乳性能、乳成分等方面的相關性引起人們的廣泛關注，其后關于β-酪蛋白（β-CN）基因的多態性也有相繼報道[2,3]。其中，β-乳球蛋白是反芻動物乳中主要乳清蛋白組分，占總乳糜的50%～60%。研究已確定編碼牛乳中β-乳球蛋白的基因主要存在A、B兩種等位基因，不同等位基因對產奶量和乳成分有不同的影響[4]。β-酪蛋白占總乳蛋白的30%，是人體氨基酸的重要來源，并能促進礦物質在人體內的消化及吸收，在一定程度上反映泌乳能力[5]，能夠作為有效評估牛乳品質的指標之一[6]。近年來國內外對于乳蛋白基因多態性進行過多次報道，對不同乳蛋白基因多態性與生產性能的關聯做了相關性研究[7～10]。研究表明，乳蛋白基因多態性與泌乳性能之間存在一定的關聯。

近年來我國奶業發展迅速，除從新西蘭、澳大利亞進口奶牛以外，2015年開始從智利引進。據不完全統計，2015年我國從智利進口奶牛共計22 817頭，北京、山東、江蘇等地均引進大批智利荷斯坦牛，占進口奶?？倲档?4.89%[11]。2017年從智利進口9 628頭，占全部進口奶?？倲档?2.1%。江蘇某大型奶牛場于2015年從智利引進荷斯坦牛6 000頭，目前大部分已處于第二胎，具有完整的生產性能記錄。本研究旨在利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析智利進口荷斯坦牛β-Lg和β-CN的基因多態性，同時探索其多態性對泌乳性能的影響，為標記輔助育種、提高智利進口荷斯坦牛的泌乳性能提供科學依據。

1 材料和方法

1．1 乳樣采集及乳蛋白的分離

2017年10月于江蘇某大型奶牛場隨機選擇健康的智利進口荷斯坦牛286頭。在進行DHI檢測采樣時，每頭牛采取混合均勻的奶樣5mL，置于冰瓶保存并迅速帶回實驗室。室溫下奶樣解凍，4 000r/min離心10min，取出下層脫脂乳，其中1mL用于保存，剩余4mL奶樣加入0.2mol/L乙酸和0.2mol/L乙酸鈉各0.15mL，調pH值至4.6。4 000r/min離心8min，吸上層乳清于-40℃保存備用。下層酪蛋白沉淀用醋酸緩沖液（pH4.6）洗滌兩次，每次4 000r/min離心8～10min，凍干于-20℃保存備用。

1．2 樣品處理

利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測樣品β-Lg和β-CN基因的多態性，并用快速染色法進行染色，7%冰醋酸中保存[10]。

1．3 數據收集與整理

數據來自該采樣牛場2016～2018年1～2胎采樣牛只的DHI記錄，主要包括牛號、采樣時間、胎次、產犢日期、泌乳天數、日產奶量、乳脂率、乳蛋白率、脂蛋白比、體細胞數、體細胞評分、尿素氮含量等信息。為保證結果的可靠性，數據不完整的記錄不納入分析，同時對DHI測定日記錄進行了限定：泌乳時間為產后第5～365天，測定日產奶量為5～60kg，乳脂率為2%～7%，乳蛋白率為2%～6%，體細胞評分為0～9。經篩選，測定日記錄數從原來的4 596條減少到最后3 185條。

1．4 統計分析

1.4.1 群體遺傳分析

用SHEsis軟件構建乳蛋白基因型單倍型，使用r2的方法進行連鎖不平衡分析，其取值范圍從0（連鎖平衡）到1（完全連鎖不平衡）。并用POPGEN（3.2）進行群體遺傳統計分析，進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，并計算基因頻率和基因型頻率、平均雜合度He和平均有效等位基因數Ne。

1.4.2 最小二乘模型

該模型為有一定固定效應且各因素間無互作的線性模型，模型如下：

式中，Yijklmno為泌乳性狀的觀察值；μ為總體均值；Yi為采樣年度的固定效應；Sj為采樣季節的固定效應；CSk為產犢季節的固定效應；Ll為泌乳階段的固定效應；β-Lgm為β-Lg基因型的固定效應；β-CNn為β-CN基因型的固定效應；eijklmno為隨機剩余效應。

在奶牛一個泌乳周期中，按泌乳時間可劃分為4個階段，產后5～100d為泌乳前期，產后101～200d為泌乳中期，產后201～305d為泌乳后期，產后306～365d為泌乳末期。按照當地氣候特點，季節劃分如下：春季為3～5月，夏季為6～8月，秋季為9～11月，冬季為12月到翌年2月。

所有數據用Excel錄入，并用SPSS（Ver16.0）分析乳蛋白基因座對奶牛泌乳性能的影響。相同因素不同水平間多重比較采用Duncan’s法。

2 結果與分析

2．1 β-Lg和β-CN基因頻率、基因型頻率及遺傳變異分析

智利進口荷斯坦牛β-Lg和β-CN基因型頻率和基因頻率值見表1。根據SHEsis軟件分析可知，β-Lg和β-CN基因均呈多態性，其中β-Lg有A、B兩種等位基因，基因頻率分別為0.477和0.523，有AA、BB、AB三種基因型，優勢基因型為AB型，頻率為0.569。β-Lg基因平均雜合度（He）為0.496，平均有效等位基因數（Ne）為1.994。經χ2檢驗β-Lg基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。

β-CN有A、B兩種等位基因，基因頻率分別為0.960和0.040，有AA和AB兩種基因型，優勢基因型為AA型，頻率為0.920。β-CN基因平均雜合度（He）為0.077，平均有效等位基因數（Ne）為1.083。經χ2檢驗β-CN基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。

β-Lg和β-CN多態基因座可構成4種單倍型（表2）。其中單倍型AA和BA的個體數最多，頻率分別為0.520和0.457。AB和BB個體最少，頻率分別為0.024和0.016。連鎖分析表明：β-Lg和β-CN之間連鎖不平衡系數為0.001，系數趨近于0，說明均處于連鎖平衡狀態。

表1 β-Lg和β-CN的基因型頻率、基因頻率及遺傳變異分析

表2 β-Lg和β-CN基因兩個位點的單倍型分析

2．2 β-Lg和β-CN多態性對智利進口荷斯坦牛泌乳性能的影響

用最小二乘模型分析各因素對荷斯坦牛泌乳性能的影響，結果由表3可知，β-Lg對日產奶量、乳蛋白率和SCS有極顯著影響（P＜0.01），對乳脂率、脂蛋白比、相鄰二次日產奶量差和相鄰二次體細胞評分差影響不顯著（P＞0.05）。多重比較分析表明：AB型個體日產奶量極顯著高于AA、BB型（P＜0.01）；BB型個體的尿素氮含量極顯著高于AA、AB型（P＜0.01）；AA、AB型個體的蛋白率和SCS極顯著高于BB型（P＜0.01）。

β-CN對乳蛋白率和脂蛋白比有顯著影響（P＜0.05）；對日產奶量有極顯著影響（P＜0.01）；對乳脂率、SCS、尿素氮含量、相鄰二次日產奶量差和相鄰二次體細胞評分差影響不顯著（P＞0.05）。多重分析表明：AB型個體的日產奶量極顯著高于AA型（P＜0.01），脂蛋白比顯著高于AA型（P＜0.05）；AA型個體的乳蛋白率顯著高于AB型（P＜0.05）。

由表4可知，在非遺傳因素方面，采樣年度對日產奶量、SCS、尿素氮含量和相鄰二次日產奶量差影響極顯著（P＜0.01），對乳蛋白率和脂蛋白比影響顯著（P＜0.05）；采樣季節對日產奶量、乳脂率、乳蛋白率、脂蛋白比、SCS、尿素氮含量和相鄰二次日產奶量差影響極顯著（P＜0.01）；產犢季節對日產奶量、乳脂率、乳蛋白率和脂蛋白比影響極顯著（P＜0.01），對SCS影響顯著（P＜0.05）；泌乳階段對日產奶量、乳脂率、乳蛋白率、脂蛋白比、SCS、尿素氮含量和相鄰二次日產奶量差有極顯著的影響（P＜0.01），對相鄰二次體細胞評分差有顯著影響（P＜0.05）；胎次對日產奶量影響極顯著（P＜0.01），對相鄰二次日產奶量差影響顯著（P＜0.05）。

3 討論

有研究表明，在不同牛品種間以及同一品種內不同地區群體間牛乳蛋白多態性存在一定的差異，如β-CN的B等位基因在麥洼牦牛中的基因頻率為1.000，表現為單態[12]；κ-CN的B等位基因在娟姍牛中頻率顯著高于在荷斯坦牛中頻率[13]。此外，Eenennaam等[13]對美國加州不同品種奶牛乳蛋白多態性的研究表明，娟姍牛β-Lg和β-CN的A基因頻率分別為0.37和0.67，而荷斯坦牛相應的基因頻率分別為0.43和0.98。陳宏宇等[7]的研究結果表明，β-Lg由A、B兩種等位基因控制，基因頻率均為0.5000；β-CN的A為優勢等位基因，基因頻率為0.9667。Auldist等[14]的研究發現，β-Lg的AA基因型控制表達的乳球蛋白比BB基因型表達的乳球蛋白高?？梢?，在不同地區以及不同品種間的牛乳蛋白基因頻率分布存在差異，然而荷斯坦牛β-Lg的B等位基因頻率在0.45～0.65之間，β-CN的A等位基因頻率高于0.95，趨于固定。

表3 β-Lg和β-CN基因多態性對智利進口荷斯坦牛泌乳性能的影響

表4 利用最小二乘模型對智利進口荷斯坦牛泌乳性能進行方差分析的F值

本研究表明，β-Lg和β-CN基因多態性對日產奶量和乳成分含量有顯著影響，與邢世宇等[10]、羅軍等[15]、郭彥斌等[16]報道的結果一致。Dario研究發現β-Lg基因的多態性與乳蛋白率有密切關系[17]，影響牛乳產量和蛋白質含量[18]，這一點與本研究一致。研究結果進一步表明，β-Lg和β-CN對于日產奶量的影響極顯著，其中β-Lg的AA基因型為影響日產奶量的優勢基因型，而邢世宇等[10]指出澳系荷斯坦牛β-Lg的AB基因型為影響日產奶量的優勢基因型，造成這些差異的原因可能是不同遺傳背景下β-Lg基因座的遺傳效應不一致。羅軍等[15]研究表明β-CN對乳脂率有顯著影響，郭彥斌等[16]研究表明β-CN對乳脂率、乳蛋白率均有顯著影響，而本研究表明β-CN對乳蛋白率的影響顯著，對乳脂率的影響不顯著。造成這些不一致的原因可能是乳蛋白各遺傳座位基因間的組合效應，如β-Lg基因通過與酪蛋白基因組合或相互作用，從而影響乳蛋白的含量[19]。邢世宇等[10]的研究表明β-Lg對SCS、尿素氮含量的影響不顯著，而本研究結果表明β-Lg對SCS、尿素氮含量的影響極顯著，造成這些差異的原因可能是不同環境中乳蛋白基因座對泌乳性狀的影響不一致。本研究對β-Lg、β-CN對相鄰二次日產量差和相鄰二次體細胞評分差的影響也進行了研究，結果均為不顯著。相鄰二次日產奶量差和相鄰二次體細胞評分差分別反映奶牛泌乳持續能力和體細胞數的變化情況，在奶業生產中有重要意義，但這方面的研究國內外均較少。影響奶牛泌乳性能的因素較多，如采樣年度、采樣季節、產犢季節、泌乳階段和胎次等非遺傳因素[20]，其對泌乳性能的影響也較大，這就要求在實踐生產中不僅要重視遺傳因素，也要重視非遺傳因素對生產性狀的影響。

4 結論

從本研究結果可知，智利進口荷斯坦牛β-Lg有A、B兩種等位基因，有AA、AB、BB三種基因型，對日產奶量、乳蛋白率、SCS和尿素氮含量均有極顯著影響；β-CN有A、B兩種等位基因，有AA和AB兩種基因型，對乳蛋白率和脂蛋白比有顯著影響，對日產奶量影響極顯著。該結果為智利進口荷斯坦牛早期選擇和泌乳性能的提高提供了參考依據。