地黃微型飲片制備工藝△

趙芳雪，史俊祖，劉穎，辜一情，姜宇婷，單國順，賈天柱

遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600

地黃為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的塊根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。作為臨床常用中藥之一，地黃具有清熱生津、涼血止血的作用[1-2]。但其個體通常較大，最長可達十幾厘米，直徑可達五六厘米，臨床使用中通常將其切制成厚2～3 mm的飲片。而這種飲片的規(guī)格較大，質(zhì)地較黏，不便于臨床調(diào)劑和有效成分的煎出，從而限制了飲片的自動調(diào)劑的發(fā)展。同時，也降低了飲片的利用率。針對上述情況，遼寧中醫(yī)藥大學的賈天柱教授提出“微型飲片”概念，即指體積較大的藥材，經(jīng)切制所得到的邊長小于0.5 cm的丁塊飲片。微型飲片作為一種新型飲片，本身具有流動性好和有效成分浸出率高的特點。因此，為了方便地黃飲片在臨床上的調(diào)劑，提高有效成分的煎出，本文擬開展具有高流動、高煎出特性的地黃微型飲片制備工藝研究，以期為中藥現(xiàn)代化的發(fā)展提供參考。

注：A.地黃藥材；B.傳統(tǒng)飲片；C.微型飲片。圖1 地黃藥材、常規(guī)飲片及微型飲片對比圖

1 材料

1.1 儀器

日本島津公司LC-20AB液相色譜儀(LC-20AB泵、CTO-20A柱溫箱、SIL-20A自動進樣器、CBM-20A數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換器)；LC-Solution色譜數(shù)據(jù)工作站(日本島津公司)；細集料流動時間測定儀(紹興市上虞越達儀器廠)；METTLER AE240型十萬分之一分析天平；FA1004B電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ZQRZG型智能化直線往復(fù)式切藥機(杭州海善制藥設(shè)備有限公司)；DHF-200手提式高速萬能打粉機(溫嶺市林大機械有限公司)；X/WT數(shù)顯調(diào)節(jié)儀電熱恒溫水浴鍋(余姚市顯星儀器有限公司)；電熱恒溫干燥箱(上海市躍進醫(yī)療器械一廠)。

1.2 試藥

地黃藥材購自大連權(quán)健中藥飲片有限公司，批號：20171025，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定為為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的干燥塊根。

梓醇、毛蕊花糖苷對照品(四川省維克奇生物科技有限公司，批號分別為：wkq16040301、wkq16062004，經(jīng)HPLC測定純度均大于98%)；乙腈為色譜純；水為純凈水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 梓醇的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 取梓醇對照品適量，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.464 0 mg·mL-1的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取地黃飲片粉末約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取1.5 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，濃縮至近干，殘渣加水溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，并用水稀釋至刻度線，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得[1]。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：Microsorb C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；PDA檢測器，檢測波長：203 nm；流動相：0.1 % 磷酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，洗脫程序：0～5 min(2%～3 % B)；5～20 min(3%～4 % B)；20～25 min(4%～4 % B)；25～30 min(4%～2 % B)；30～40 min(2%～2 % B)色譜圖見圖2[1]。

注：A.梓醇對照品；B.地黃飲片；1.梓醇。圖2 梓醇對照品及地黃飲片色譜圖

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取梓醇對照品溶液1、2、5、10、20、40 μL，注入高效液相色譜儀，按照2.1.3項下色譜條件進行測定，以對照品進樣量(μg)為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y，繪制標準曲線。結(jié)果梓醇的回歸方程為Y=151 119X+105 774(r=0.999 7)，表明梓醇進樣量在0.464 0～18.56 μg具有良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗 分別精密吸取同一供試品溶液，按2.1.3項下操作，連續(xù)進樣6次，記錄色譜峰面積，結(jié)果梓醇峰面積的RSD為0.95%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗 取同一地黃樣品粉末6份，按照2.1.2項下方法制備供試品溶液，并按2.1.3項下色譜條件進行分析，結(jié)果梓醇含量的RSD為1.01%，表明本法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取地黃供試品溶液，室溫放置，按2.1.3項下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣分析，記錄各自峰面積，結(jié)果梓醇峰面積的RSD為1.01%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率試驗 取已知含量的地黃飲片6份，每份約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，每組分別加入梓醇對照品溶液7 mL，按照2.1.2項下方法制備供試品溶液，并按2.1.3項下色譜條件進行分析，結(jié)果見表1。

表1 梓醇加樣回收率結(jié)果(n=6)

2.2 毛蕊花糖苷的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 取毛蕊花糖苷對照品適量，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.203 0 mg·mL-1的對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 取地黃樣品粉末約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流提取1.h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，濃縮至近干，殘渣加水溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，并用水稀釋至刻度線，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得[1]。

2.2.3色譜條件 色譜柱為Welch Xtimate C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：334 nm；流動相：0.1%醋酸水-乙腈(82∶18)，進樣體積為20 μL，色譜圖見圖3[1]。

注：A.毛蕊花糖苷對照品；B.地黃飲片；1.毛蕊花糖苷。圖3 毛蕊花糖苷對照品及地黃飲片色譜圖

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取毛蕊花糖苷對照品溶液1、2、5、10、20、40 μL，注入高效液相色譜儀，按照上述色譜條件進行測定，以對照品進樣量(μg)為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y，繪制標準曲線。結(jié)果毛蕊花糖苷的回歸方程為Y=2 830 600X+11 700(r=0.999 8)，表明毛蕊花糖苷在進樣量0.203 0～8.120 μg具有良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗 分別精密吸取同一供試品溶液，按2.2.3項下操作，連續(xù)進樣6次，記錄色譜峰面積，結(jié)果毛蕊花糖苷峰面積的RSD為1.19%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗 取同一地黃樣品粉末6份，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，并按2.2.3項下色譜條件進行分析，結(jié)果毛蕊花糖苷含量的RSD為0.90%，表明本法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取地黃供試品溶液，室溫放置，按2.2.3項下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣分析，記錄各自峰面積，結(jié)果毛蕊花糖苷峰面積的RSD為1.89%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的地黃飲片6份，每份約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，每組加入毛蕊花糖苷對照品溶液1 mL，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，并按2.2.3項下色譜條件進行分析，結(jié)果見表2。

表2 毛蕊花糖苷加樣回收率結(jié)果(n=6)

2.3 飲片煎膏率的測定

取飲片樣品5 g，精密稱定，加10倍量冷水浸泡40 min，直火加熱，水沸后改用文火煎煮30 min，濾過，藥液備用；藥渣加8倍量水，繼續(xù)煎煮，水沸后改用文火煎煮20 min，濾過，合并兩次藥液，定容至100 mL量瓶中，混勻。精密量取上述煎煮液50 mL，置己恒重的蒸發(fā)皿中，于沸水浴上濃縮至干，然后置于烘干箱中105 ℃烘至恒重，記錄煎膏質(zhì)量并計算煎膏率。

(1)

2.4 地黃飲片制備成品率的測定

地黃藥材低溫干燥，控制水分含量小于8%。取上述地黃藥材100 g，清水悶潤至軟后進行切制，樣品干燥后，控制含水量小于8%，稱定成品飲片的質(zhì)量并計算成品率。

(2)

2.5 飲片的流動性考察

每次稱取100 g地黃微型飲片，采用細集料流動時間測定儀，記錄打開閥門到樣品全部流出測定儀的時間，即為樣品的流動時間，每個樣品測定10次。

2.6 飲片切制工藝優(yōu)化研究

2.6.1 正交試驗設(shè)計及方法 根據(jù)前期文獻調(diào)研及初步預(yù)試驗研究，確定切制方式(A)、粒徑(B)、干燥溫度(C)為考察因素，每個因素設(shè)定3個水平，不考慮交互作用，選用L9(34)正交表設(shè)計試驗，因素水平表見表3。

表3 正交試驗因素水平表

微型飲片的切制：各組實驗均先以切藥機進行切片，然后按照微型飲片切制工藝的設(shè)計，手工碼放于切藥機中，再按照縱切與橫切的組合方式，進行二次切條和三次成粒。

本試驗的結(jié)果采用綜合評分法進行評價，根據(jù)各指標在微型飲片制備工藝及成品質(zhì)量的貢獻大小設(shè)計權(quán)重。各組實驗，以成品率最高的計為10分，其相應(yīng)計分為A×10/最高成品率；以煎膏率最高者計為30分，其相應(yīng)計分為B×30/最高煎膏率；以有效成分梓醇及毛蕊花糖苷的煎出率最高值計為30分，其他各組相應(yīng)計分為C×30/煎出率最高得分；以流動時間最快得分計為30分，其相應(yīng)計分為D×30/流動時間最快組。(即：綜合評分P=A×10/最高成品率+B×30/最高煎膏率+C×30/活性成分煎出率最高得分+30×流動時間最小/D。其中，A為成品率，B為煎膏率，C為活性成分梓醇及毛蕊花糖苷的煎出率得分，D為流動時間)。

為了考察地黃切制成微型飲片后主要活性成分梓醇及毛蕊花糖苷在水煎液中煎出效果是否受到影響。筆者以水煎液中梓醇(毛蕊花糖苷)的含量與藥材中梓醇(毛蕊花糖苷)的含量相除，計算活性成分的煎出率。并采用綜合得分法設(shè)計活性成分的煎出率得分。具體煎出率得分O=E×50/梓醇的最高煎出率+F×50/毛蕊花糖苷最高煎出率(E為梓醇的煎出率，F(xiàn)為毛蕊花糖苷的煎出率)。

2.6.2 試驗方法及結(jié)果 按正交表安排進行試驗，正交試驗安排及試驗測定結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。

表4 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

由試驗結(jié)果分析可知，各因素對綜合得分影響大小依次為A>C>B，即切制方式>干燥溫度>粒徑，由此確定地黃微型飲片的切制工藝為A2B2C3，即生地黃以先縱切，再橫切的方式，切制成0.3～0.4 mm3的小丁塊，并以80 ℃烘干。

表5 方差分析結(jié)果

注：F0.05(2，9)=19；F0.01(2，9)=99；*為P<0.05；**為P<0.01。

由方差分析結(jié)果可知，切制方式及干燥溫度對地黃微型飲片的制備工藝的影響差異有統(tǒng)計學意義，粒徑也對地黃微型飲片的制備工藝的影響差異有統(tǒng)計學意義，因此，結(jié)合綜合得分確定地黃微型飲片的切制工藝為A2B2C3，即生地黃以先縱切，再橫切的方式，切制成0.3～0.4 mm3的小丁塊，并以80 ℃烘干。

2.6.3 最佳工藝驗證試驗 稱取3份生地黃樣品各100 g，以最佳工藝方法切制，并按2.2、2.3、2.4、2.5項下方法測定地黃微型飲片中的梓醇、毛蕊花糖苷含量、煎膏率、成品率及流動時間。結(jié)果見表6。

表6 驗證試驗

結(jié)果表明，3份樣品中成品率、煎膏率、梓醇、毛蕊花糖苷含量均較高且流動時間較短，表明該工藝切實可行。

3 討論

地黃作為臨床常用的大品種，主要含有環(huán)烯醚萜及其苷類、紫羅蘭酮類、苯乙醇苷類、糖類、氨基酸及微量元素等[3-5]。其中，環(huán)烯醚萜苷類和苯乙醇苷類是地黃中主要活性成分，也是發(fā)揮療效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，我們在2015版《中華人民共和國藥典》地黃項下含量測定方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合相關(guān)文獻報道建立了地黃飲片中環(huán)烯醚萜苷類梓醇及苯乙醇苷類成分毛蕊花糖苷的含量測定方法，并用于地黃飲片的質(zhì)量控制及炮制工藝的優(yōu)化[6-7]。

“飲片”其名源于古人將切制后的藥片加水做成“飲劑”飲用而來，最早出現(xiàn)在南宋著名學者周密的《武林舊事》中，“熟藥圓散，生藥飲片”，并一直沿用至今[8]。長久以來，作為中藥應(yīng)用于臨床的最終形式，飲片一直以粗放、簡陋的形式呈現(xiàn)在世人面前。由于片型各異，只能以戥秤調(diào)劑，既增加了調(diào)劑人員的工作量，又制約了調(diào)劑的精度和速度。因此，近年來中醫(yī)藥科研工作者在飲片的“形”上進行多次改進，先后推出了濃縮顆粒、超微飲片等一系列產(chǎn)品，但由于這些“飲片”缺少共煎過程，使其應(yīng)用受到限制；接著又推出了小包裝飲片，但又產(chǎn)生了二次污染，且調(diào)劑人員看不到藥，不識藥，亦存在大量缺點[9-10]。鑒此，“微型飲片”應(yīng)運而生，作為一種新型飲片，微型飲片在保留傳統(tǒng)飲片特色的同時，化大為小，既可提高藥材有效成分的煎出率，減少飲片使用量，又增加了飲片的流動性，便于調(diào)劑和煎煮，更適用于智能調(diào)劑和煎煮系統(tǒng)的應(yīng)用[11]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，隨著飲片粒徑的降低，其煎膏率及有效成分煎出率均增加，這一結(jié)果也在一定程度上反映出微型飲片研究的合理性。但也有研究指出，飲片粒徑過細在煎煮過程中易出現(xiàn)糊鍋及不易過濾現(xiàn)象[12-18]。因此，本研究綜合上述因素來設(shè)定地黃微型飲片的粒徑，從而既保證有效成分的煎出，又保持其良好的流動性且不易出現(xiàn)糊鍋和不易過濾的現(xiàn)象。

微型飲片的流動性對于飲片自動調(diào)劑具有積極的意義。鑒于微型飲片的顆粒狀屬性，藥物制劑領(lǐng)域的休止角測定并不適合對微型飲片的流動性進行考察。因此，我們采用了建筑工程領(lǐng)域的細集料流動時間測定儀，并經(jīng)過適當改進，以適應(yīng)微型飲片流動性測定的需要。

微型飲片作為一種新型飲片，其本身具備“規(guī)格劃一，流動可調(diào)”的優(yōu)點。但是，作為一種新生事物，微型飲片本身尚存在許多問題需要解決。其中，最重要的是對炮制工藝的規(guī)范。本研究正是通過正交試驗的方法對地黃微型飲片的最佳制備工藝進行驗證，證明了該工藝確實可行，適用于工業(yè)化生產(chǎn)的需求。未來實驗將會進一步對微型飲片與常規(guī)飲片及細粉之間的藥理藥效、特征圖譜等方面進行比較研究，從而為微型飲片的安全性提供數(shù)據(jù)支持。