不同加工方法對(duì)丹參中丹酚酸B和醇溶性浸出物的影響△

侯曉杰，張建鋒，李瑋*，吳珊珊

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.國(guó)藥集團(tuán)同濟(jì)堂(貴州)制藥有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550009；3.國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025

丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，春、秋二季采挖，除去泥沙，干燥。其具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、涼血消癰、清心除煩的功能，用于胸痹心痛、癥瘕積聚、脘腹脅痛、心煩不眠、熱痹疼痛、月經(jīng)不調(diào)和經(jīng)閉痛經(jīng)等治療[1]。傳統(tǒng)認(rèn)為丹參多以治療心血管系統(tǒng)疾病為主，但現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其在抑菌、抗炎、心機(jī)保護(hù)、抗腫瘤、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等諸多方面，仍具有較強(qiáng)的藥理作用[2-6]，主要包括丹參酮ⅡA、丹參素和丹酚酸等成分。

中藥產(chǎn)地加工是中藥品質(zhì)形成的重要環(huán)節(jié)，同時(shí)也是影響臨床用藥的重要因素。丹參藥材的產(chǎn)地加工一般采用產(chǎn)地采收后曬干，或?qū)⒌⒘罆裰涟敫啥褠灐鞍l(fā)汗”后曬干[7-8]。2015版《中華人民共和國(guó)藥典》收載丹參的加工方法為“除去雜質(zhì)和殘莖，洗凈，潤(rùn)透，切厚片，干燥”。不同的加工炮制方法對(duì)丹參中化學(xué)成分的影響有差異，在丹參炮制品中，酒丹參中丹酚酸B含量最高，醋丹參次之，其次是生丹參，米炒丹參和炒丹參中丹酚酸B的含量很少，丹參炭中丹酚酸B的含量最低[9]。目前不同產(chǎn)地加工方法對(duì)丹參中丹酚酸B和醇溶性浸出物影響的報(bào)道甚少。為更好地控制和提高丹參質(zhì)量，采用不同加工方法對(duì)丹參藥材進(jìn)行研究，對(duì)不同加工方法對(duì)丹參成分丹酚酸B和醇溶性浸出物的影響因素進(jìn)行分析，優(yōu)選丹參適宜的產(chǎn)地加工方法，為提高丹參質(zhì)量和控制其品質(zhì)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀，包括：LC-20AT二元梯度泵、SPD-20A檢測(cè)器[島津企業(yè)管理(日本)有限公司]；遠(yuǎn)紅外干燥箱(YHG-600-S型，上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；十萬(wàn)分之一電子天平[AUW-220 D型，島津儀器(蘇州)有限公司]；千分之一電子天平(金諾JT-5003型，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)；超聲清洗機(jī)(HS10260D，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試藥

對(duì)照品丹酚酸B(貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司，批號(hào)：115939-25-8)；甲醇為色譜純；水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。

丹參鮮藥材由貴州中醫(yī)藥大學(xué)魏升華教授鑒定為正品，由貴陽(yáng)德昌祥藥業(yè)有限公司丹參藥材種植基地提供。

2 方法

2.1 不同加工方法

詳見(jiàn)表1。

表1 不同加工方法的操作步驟

2.2 丹酚酸B含量的測(cè)定及方法學(xué)考察

2.2.1 色譜條件 流動(dòng)相：甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)；流速：1.0 mL·min-1；色譜柱：WondaSil C18-WR(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：286 nm；柱溫：25 ℃。理論板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)定丹酚酸B對(duì)照品適量，置于10 mL棕色容量瓶，用60%甲醇溶解并稀釋定容至10 mL，搖勻。即得質(zhì)量濃度為0.262 5 mg·mL-1的丹酚酸B對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)定丹參粉末0.2 g，置于100 mL平底燒瓶中，精密加入60%甲醇40 mL，稱(chēng)定重量，在強(qiáng)超聲頻率下提取40 min，靜置放冷，用60%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。根據(jù)以上色譜條件得到丹酚酸B色譜圖和丹參樣品色譜圖，見(jiàn)圖1～2。

圖1 酚酸B對(duì)照品色譜圖

圖2 丹參樣品色譜圖

2.2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取1、6、10、18、22、25 μL對(duì)照品，分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得出丹酚酸B回歸方程。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10 μL，按照上面色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算RSD值，得出儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按供試品溶液的制備方法，平行制備6份供試品溶液，計(jì)算RSD值，顯示重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10 μL，于0、2、4、8、16、24 h分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算RSD值，表明其在24 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率 精密稱(chēng)取6份丹參樣品各約0.1 g，加入0.240 1 mg丹酚酸B對(duì)照品，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算回收率和RSD，表明該方法具有較好的準(zhǔn)確性。

2.2.9 樣品測(cè)定 對(duì)不同加工方法的樣品分別精密稱(chēng)取約0.2 g，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，對(duì)樣品中丹酚酸B的含量測(cè)定和計(jì)算。

2.3 醇溶性浸出物含量測(cè)定

測(cè)定方法照2015版《中華人民共和國(guó)藥典》四部浸出物測(cè)定法(2201)項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定。

3 結(jié)果與分析

3.1 方法學(xué)考察

依據(jù)線(xiàn)性關(guān)系考察的結(jié)果可得丹酚酸B回歸方程：Y=1×106X-18 616(r=1)，結(jié)果表明，丹酚酸B在0.262 5～6.561 9 μg線(xiàn)性關(guān)系良好。丹酚酸B的精密度試驗(yàn)RSD為1.70%，表明儀器精密度良好。丹酚酸B的重復(fù)性試驗(yàn)RSD為1.64%，表明本法重復(fù)性良好。丹酚酸B的穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD為1.67%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。丹酚酸B平均加樣回收率為100.52%(n=6)，RSD為1.97%，表明方法的準(zhǔn)確度良好。

3.2 不同加工方法的丹酚酸B和醇溶性浸出物含量

應(yīng)用不同加工方法對(duì)丹參的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同加工方法的丹參中丹酚酸B和醇溶性浸出物的含量(n=34) %

由表2可知采用不同產(chǎn)地加工方法對(duì)丹酚酸B和醇溶性浸出物均有較大影響。丹酚酸B以丹參洗后曬干含量最高，40 ℃烘發(fā)汗后60 ℃烘干最低；在醇浸出物中，以洗后鮮切采用40 ℃烘干含量最高，以洗后采用100 ℃烘干最低。在不同加工方法中，丹參兩種成分的含量陰干、曬干差異不明顯，鮮切、烘干、發(fā)汗法與之比較則有明顯差異，表明不同產(chǎn)地加工方法對(duì)丹參中丹酚酸B和醇溶性浸出物的含量影響顯著。同時(shí)從表2中還可以看出干燥溫度對(duì)丹酚酸B和醇溶性浸出物均有影響，溫度在不同的加工方法中對(duì)有效成分也有影響。對(duì)不穩(wěn)定的酚酸類(lèi)成分，對(duì)其采用鮮切法，在40 ℃烘干效果優(yōu)于60、80、100 ℃烘干效果，隨著溫度升高，丹酚酸B含量下降，除60 ℃樣品洗后鮮切烘干外，其余含量相差不大，其原因有待進(jìn)一步研究。烘干法中，無(wú)論是直接烘干還是洗后烘干，隨著溫度的升高其含量也有所下降，洗后60 ℃烘干除外。在發(fā)汗法中，晾曬發(fā)汗后烘干的藥材隨著溫度的升高其含量有升高的趨勢(shì)，以80 ℃為好，100 ℃則下降；烘后發(fā)汗的藥材隨溫度的升高丹酚酸B含量增加，結(jié)果顯示在發(fā)汗前最快速度失去部分水分是有利的，適當(dāng)縮短干燥時(shí)間對(duì)保存成分是有利的。植物體內(nèi)的生物酶是否影響整個(gè)過(guò)程，有待進(jìn)一步探討。對(duì)醇溶性浸出物來(lái)說(shuō)采用烘干法的藥材，無(wú)論是直接或洗后40 ℃烘干均好于直接或洗后60、80、100 ℃烘干，整體上隨著溫度的升高，醇溶性浸出物的含量明顯下降；鮮切法中規(guī)律與烘干法中一致，鮮切100 ℃烘干樣品除外。在發(fā)汗法中，晾曬發(fā)汗后烘干的藥材隨著溫度的升高其含量有升高的趨勢(shì)，以80 ℃為好，100 ℃則下降。整體上從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，無(wú)論哪種發(fā)汗方法醇溶性浸出物含量差異不大，相對(duì)而言，晾曬發(fā)汗優(yōu)于烘后發(fā)汗，其原因有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論與討論

結(jié)果顯示，對(duì)丹參采用不同產(chǎn)地加工方法，其丹酚酸B和醇溶性浸出物有較大影響，丹酚酸B含量以丹參洗后曬干的方法最高，其含量達(dá)到17.057 1%，醇溶性浸出物以洗后鮮切40 ℃烘干的方法處理后含量最高，其含量為25.293 0%。

丹參產(chǎn)地加工時(shí)有“忌水洗”的說(shuō)法。丹酚酸B為水溶性成分，在烘干法中40、80 ℃烘干以及鮮切法中曬干、40 ℃烘干、60 ℃烘干的含量均比洗后高；醇溶性浸出物在曬干法、烘干法中40、80、100 ℃烘干以及鮮切法中陰干、曬干、100 ℃烘干的

含量均高于洗后的，“忌水洗”是有道理的。但丹酚酸B在烘干法中的其他溫度處理以及鮮切法、陰干、曬干法處理的藥材，其含量均比洗后處理的含量低；醇溶性浸出物在陰干法、烘干法中60 ℃烘干以及鮮切法中40、60、80 ℃烘干的樣品中的含量均低于洗后處理的，水洗對(duì)其含量影響不顯著。

發(fā)汗法是丹參藥材產(chǎn)地加工方法之一，丹參發(fā)汗后內(nèi)部顏色變?yōu)樽虾稚Ｑ芯勘砻鳎l(fā)汗法中的丹酚酸B和醇溶性浸出物相對(duì)較低，兩種成分的含量均低于其他方法，與文獻(xiàn)報(bào)道“發(fā)汗法”為丹參傳統(tǒng)的產(chǎn)地加工方法相悖，其產(chǎn)地加工方法有待進(jìn)一步研究。