Box-Behnken響應面法優選心痛寧膠囊的水提工藝△

劉怡，如扎·哈布都拉，李露，王萍，2，孟瑤，依孜提·帕力哈提，張麗娟，聶繼紅，2*

1.新疆醫科大學，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫科大學第四臨床醫學院，新疆 烏魯木齊 830000

心痛寧膠囊是國醫大師沈寶藩教授以“痰瘀同治”為指導，臨床應用三十余年的經驗方。

它由丹參和紅花等藥材組成，可顯著改善冠心病患者的臨床癥狀。現代藥理研究表明，方中丹參、紅花等中藥材具有抗血小板聚集、抗血栓形成等多重藥理作用[1-5]。最初的處方是湯劑，后被開發成膠囊以便于攜帶和儲存。

Box-Behnken響應面法是優化工藝條件的有效方法，廣泛應用于多因素試驗優化[6-7]。經過優選得到的心痛寧膠囊的水提工藝合理，可操作性強，為將來的生產提供參考。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Waters-2695)；紫外-可見分光光度計(Cintra20)；SI-234電子天平[丹佛儀器(北京)有限公司]；Direct-QTM5超純水儀(Millipore)；xXMTD-4000型電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫療儀器有限公司)。

1.2 試藥

丹酚酸B對照品、D-無水葡萄糖對照品(中國食品藥品檢定研究院)；磷酸為分析純；甲醇、乙腈為色譜純。

丹參、紅花等藥材飲片均購買于亳州市中正藥材飲片有限公司，經檢驗符合2015版《中華人民共和國藥典》收載各飲片項下的質量要求。

2 方法與結果

2.1 丹酚酸B的含量測定

2.1.1 色譜條件與系統適用性試驗 色譜柱Shield RP18(250 mm×4.6 mm，5m)；流動相：乙腈-0.1%磷酸(29∶71)；體積流量：1.0 mL·min-1；檢測波長：286 nm；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃[8-10]。

2.1.2 對照品溶液的制備 稱取精準適量對照品，通過使用色譜甲醇制備質量濃度為0.5 mg·mL-1的丹酚酸B儲備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 根據提出的試驗方案，提取稱重的水提取物并置于1000 mL圓底燒瓶中，加入10倍量水并加熱回流1 h，冷卻后，將提取液經紗布過濾，離心1 h后取上清液10 mL蒸干，在完全溶解5 mL甲醇后，溶解液用0.45 μm濾膜濾過，取續濾液，即得。

注：A.丹酚酸B對照品；B.心痛寧膠囊水提液供試品；C.缺丹參的陽性對照。圖1 心痛寧膠囊中丹酚酸B的含量測定結果圖

2.1.4 陰性樣品溶液的制備 稱取不包括丹參在內其余擬水提的飲片，提取制備陰性樣品溶液。

2.1.5 線性范圍研究 準確測定在2.1.2項下丹酚酸B的儲備液，用色譜甲醇分別稀釋至0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·mL-1，分取這5個不同質量濃度梯度的溶液，注入液相色譜儀，得回歸方程：Y=12 951 793X-32 554.7(r=0.999 9)，其中X為濃度，Y為對應的峰面積，體現在0.1～0.5 mg·mL-1線性關系良好。

2.1.6 精密度試驗 取一份制備好的參比液，連續進樣6次，試驗最終得到的RSD值為0.54%，表明方法的精密度良好。

2.1.7 重復性試驗 按照規定的方法并行準備6份試驗溶液并分別進樣，得到的峰面積的RSD值為1.44%，表明該方法重復性良好。

2.1.8 穩定性試驗 取相同的試驗溶液，在制備后的第0、6、8、12、24、48 h進樣，丹酚酸B峰面積的RSD值為1.99%，說明該方法的穩定性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 取6份待測樣品，從中吸取一定量，按同比量加入丹酚酸B參比物后記錄其峰面積，結果平均加樣回收率為103.48%，RSD值為1.11%，表明該分析方法準確。

2.2 總多糖的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 使用超純水制備質量濃度為0.05 mg·mL-1的D-無水葡萄糖參比物儲備溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 根據試驗方案提取飲片并保存以備后用。

2.2.3 苯酚溶液的制備 用溫水制取5%的苯酚溶液，低溫貯存避光。

2.2.4 最大吸收波長的確定 分別精密吸收D-無水葡萄糖對照品溶液0.1 mL，將0.1 mL樣品溶液置于1000 mL的量瓶中，用等體積的超純水稀釋，充分混勻，加入0.1 mL稀釋劑，置于10 mL試管中，將5%苯酚溶液1 mL和濃硫酸溶液5 mL加入1 mL的超純水中混合10 min，然后，將混合物在沸水中加熱20 min，取出空白液體，并將混合物快速冷卻至室溫，并以相同的方式制備空白液體用于測量，掃描結果見圖2，波長范圍為350～700 nm[11-13]。結果表明，樣品溶液和對照物在485.6 nm處有最大吸收。

2.2.5 標準曲線的制備 分別準確吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL儲備液。在上述顯色方法下分別測定其吸光度(A)。將吸光度作為縱坐標，將D-無水葡萄糖濃度作為橫坐標，得回歸方程：Y=14.58X+0.071 8(r=0.999 9)，說明D-無水葡萄糖在0.01～0.05 mg線性關系良好。

圖2 總多糖紫外吸收光譜

2.2.6 精密度試驗 準確吸量適當D-無水葡萄糖，按規定方法顯色后連續測量6次，RSD值為0.26%，說明該方法的精密度良好。

2.2.7 重復性試驗 根據測試方案平行制備6個樣品，RSD值為0.42%，說明該方法重復性良好。

2.2.8 穩定性試驗 準確吸收適量的試樣溶液，分別于制備后的第0、30、60、90、120、150、180 min按上述方法顯色，測定吸光度以獲得RSD值為1.15%，表明樣品溶液在3 h內較穩定。

2.2.9 加樣回收率試驗 取已知D-無水葡萄糖濃度的試樣溶液，制備6個樣品和對照品含量為1∶1的混合液，并通過上述方法測量吸光度，結果平均加樣回收率為98.09%，RSD值為0.28%。

2.3 浸膏得率的測定

用移液管吸量50 mL供試品溶液上清液，放入已重量恒定的坩堝中，先在水浴鍋中蒸干后轉移至烘箱內，設置105 ℃后，干燥至恒定質量，取出，冷卻，稱重干燥器并計算提取物產量[14]。

(1)

2.4 提取工藝的研究

以加水倍量(X1)、提取時間(X2)和浸泡時間(X3)作為自變量來研究提取過程。以丹酚酸B、總多糖的含量及浸膏得率的綜合評分為因變量，根據評價指標對水提工藝的影響，擬定綜合評分=丹酚酸B×0.4+總黃酮×0.3+浸膏得率×0.3。

2.5 單因素試驗

通過浸泡時間、加水量、提取時間，測試提取次數，并且基于分析結果來確定Box-Behnken響應面測試的因素范圍[15-17]。

2.5.1 加水倍量初步考察 加水倍量的初始評價將提取次數固定為1次，提取時間固定為60 min，浸泡時間固定為30 min。依次考察加水倍量6、8、10、12倍時的綜合評分，結果在加水10倍量時，綜合評分最高。因此，作為響應面設計范圍的加水倍量為8、10、12倍，最佳為10倍。

2.5.2 提取時間初步考察 提取時間初始評價將加水倍量固定為10倍，浸泡時間固定為30 min，提取次數固定為1次。依次考察提取30、60、90、120 min時的各組分含量，結果提取60 min時得到最高評分，因此，提取30、60、90 min作為響應表面設計范圍，并且提取60 min是最佳的。

2.5.3 浸泡時間初步考察 浸泡時間初始評價將加水倍量固定為10倍，提取時間固定為60 min，提取時間固定為1次。浸泡時間依次為60、90、120、150 min，結果浸泡120 min時，綜合評分達到最高。因此，作為響應面設計范圍的浸泡時間為90、120、150 min，最佳浸泡時間為120 min。

2.5.4 提取次數的初步考察 初步將加水倍量固定為10倍，提取時間固定為60 min，浸泡時間固定為120 min。經過提取1、2和3次后，最終綜合評分依次增加，因此提取次數確定為3次。

2.6 Box-Behnken響應面法優化提取工藝

基于單因素試驗，確定了Box-Behnken響應面設計中各因素的適用范圍[18]。Box-Behnken響應面設計采用加水倍量(X1)、提取時間(X2)和浸泡時間(X3)作為指標，按表1進行試驗。提取次數固定為1次。結果見表2。

2.6.1 結果分析 利用方差分析對各因素進行多元二次回歸，得到的回歸方程Y=93.47+7.19X1+2.41X2+1.80X3-6.49X1X2-0.050X1X3-2.78X2X3-16.73X12-18.51X22-10.10X32，由表3可知，X1、X2、X1X2、X12、X22、X32的影響顯著，影響程度為X1>X2>X3。失擬項P>0.05，回歸方程可以更好地分析和預測本研究的水提過程。

2.6.2 響應面分析與優化 響應面分析和優化使用Design-Expert軟件[19-20]，獲得了加水倍量、提取時間、浸泡時間的綜合評分的三維響應面圖，結果見圖3～4，能直接反映3個自變量與綜合得分之間的相互作用。利用Design-Expert軟件預測了最佳提取工藝：加水10.87倍，浸泡128.30 min，提取58.72 min。根據實際生產要求，確定了最佳的水提工藝流程：加水11倍，提取60 min，浸泡130 min，提取3次。

表1 Box-Behnken設計的因素及水平

表2 Box-Behnken設計及結果

表3 回歸模型的方差分析

2.6.3 驗證試驗 根據最佳提取工藝，進行了3次平行驗證試驗，綜合得分為99.56、98.34、99.84，平均綜合得分為99.25(RSD為0.80%)，與預測值(94.33)一致。結果表明，該方法是合適的，優化后的提取工藝是合理可行的。

圖3 各因素對綜合評分的三維響應面圖

圖4 提取工藝對各因素之間的等高線圖

3 討論

丹參中富含的丹參酮和丹酚酸B有顯著的抗血小板凝集作用，相比于含量低、穩定性差的丹參酮類成分，水溶性的酚酸類成分具有藥理活性相對較強、含量高等特點，故本研究選用了易溶于水的丹酚酸B作為指標性成分。

參考2015年版《中華人民共和國藥典》，采用乙腈-0.1%磷酸(22∶78)作為流動相測定丹酚酸B，但分離度及峰形效果不符合要求，因而調整了乙腈-0.1%磷酸的比例，最后將流動相確定為乙腈-0.1%磷酸(29∶71)。

Box-Behnken響應面法可以在因素和響應值之間建立模型，它不僅能擬合相關數據，篩選出最佳工藝，而且能夠準確預測試驗結果，精度高。另外，Box-Behnken響應面法克服了正交試驗無法得到整體因素中的最佳組合及響應值的缺點，在未來中藥領域的研究中將會得到廣泛應用。本研究以丹酚酸B、總多糖含量和浸膏得率的綜合評分為指標，運用Box-Behnken響應面法對心痛寧膠囊的水提工藝進行優化，建立了綜合評分與各自變量之間的數學模型，為心痛寧膠囊的大規模生產提供參考。