基于GC-MS技術對甘肅隴南大紅袍花椒揮發油檸檬烯 芳樟醇含量的測定△

司昕蕾，蔡秀榮，曹瑞，邊甜甜，辛二旦，牛江濤，張愛霞，李越峰*

1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥質量與標準研究重點實驗室，甘肅 蘭州 730000 3.蘭州佛慈制藥股份有限公司，甘肅 蘭州 734000

花椒為蕓香科植物青椒ZanthoxylumschinifoliumSieb.et Zucc或花椒ZanthoxylumbungeanumMaxim的干燥成熟果皮[1]?；ń返南銡獬煞謥碜杂谄浣M織中所含的揮發油，其揮發油是由萜烯等有機化合物及其含氧衍生物醇、醛、酮、酯等成分組成，是一種揮發性的油狀物質[2]。甘肅省隴南市武都區是中國名特優經濟林花椒之鄉，其所產的花椒具有粒大飽滿、麻味醇厚、藥效成份多、揮發油含量高等特點[3]。檸檬烯、芳樟醇在花椒中含量較高，是花椒的特征性成分[4]，測定甘肅隴南大紅袍花椒揮發油中檸檬烯、芳樟醇可有效的控制其質量。近年來GC-MS技術經常用于揮發油、揮發性成分定量及鑒定研究[5-7]，遂本文采用GC-MS測定及鑒定甘肅隴南大紅袍花椒揮發油中檸檬烯、芳樟醇。

1 材料

1.1 儀器及設備

HY-04 型高速粉碎機(上海菲力博寶業公司 型號：LFP-500A)；萬分之一分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司 型號：AL104)；HH-S 型恒溫水浴鍋(余姚市檢測儀表廠)；7890A-5975C 型氣相色譜-質譜聯用儀，FID檢測器，HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，MSD化學工作站，NIST1譜庫，GC-MS數據分析工作站。棕色容量瓶，玻璃棒，離心管，移液管，移液槍；一次性使用無菌注射器(湖北康友醫用器材有限公司 規格：1 mL)；0.45 μm微孔濾膜。

1.2 試劑

正己烷(色譜純 天津市大茂化學試劑廠)，哇哈哈純凈水。

1.3 對照品

檸檬烯(20 mg，北京北納創聯生物技術研究院 批號：180109)；芳樟醇(20 mg，北京北納創聯生物技術研究院 批號：170912)。

1.4 藥材

隴南大紅袍花椒，采購自甘肅省隴南市，藥材經甘肅中醫藥大學鑒定教研室王明偉教授鑒定符合2015版《中華人民共和國藥典》一部規定。

樣品預處理：樣品粉碎過30目篩。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品母液制備 分別精密稱取檸檬烯和芳樟醇20.00 mg，分別置于5.0 mL容量瓶中，用正己烷定容，得標準品儲備液[8]。

2.1.2 供試品溶液制備 采用水蒸氣蒸餾法，分別稱取花椒粉末20.00 g，于1000 mL的具塞錐形瓶中，加入10倍量的水與沸石數粒，振搖混合后，連接揮發油測定器與回流冷凝管自冷凝管上端加水使充滿揮發油測定器的刻度部分，并溢流人燒瓶時為止。置電熱套中緩緩加熱至沸，并保持微沸約5小時，至測定器中油量不再增加，停止加熱，放置片刻，開啟測定器下端的活塞，將揮發油緩緩放出。取揮發油30 μL加正己烷定容至10 mL，再用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品[9]。

2.2 進樣條件

2.2.1 色譜條件 HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。載氣為氮氣，載氣流量為1.0 mL·min-1。程序升溫，起始溫度60 ℃，保持2 min，以3 ℃·min-1升溫至165 ℃，然后以20 ℃·min-1升溫至280 ℃，保持5 min。進樣量1μL，分流進樣，分流比為10∶1；汽化室溫度為250 ℃[10]。

2.2.2 質譜條件 EI 離子源，電壓70 eV，溫度230 ℃；四級桿質量監測器，溫度150 ℃；掃描范圍m/z：40～500 amu；溶劑延遲4 min。

2.3 含量測定

2.3.1 線性關系考察 精密吸取上述對照品母液加正己烷稀釋，得到檸檬烯的濃度系列為：0.16、0.24、0.32、0.48、0.56、0.64、0.8 mg·mL-1，芳樟醇的濃度系列為：0.32、0.40、0.48、0.56、0.64、0.80、0.96 mg·mL-1；按“2.2.1”項下的色譜條件分別進樣，以進樣量對峰面積積分值進行回歸處理，得檸檬烯、芳樟醇的標準曲線。

2.3.2 樣品含量測定 按“2.2.1”項下方法測定供試品溶液，在上述色譜條件下分析，用面積外標法計算花椒中檸檬烯、芳樟醇的含量。

2.4 方法學考察

2.4.1 重復性試驗 取同一批號隴南大紅袍花椒粉末6份，按“供試品溶液的制備”方法，對樣品分別制備12份供試品溶液，分別在上述色譜條件下進樣，測定乙酸芳樟酯的含量。

2.4.2 穩定性試驗 精密吸取0.7 mg·mL-1的對照品溶液0.2 μL在0、2、4、6、10、12、24 h進樣，測定乙酸芳樟酯的含量。

2.5 成分鑒定

將制備所得提取液經0.45 μm微孔濾膜過濾之后，用微量進樣器進樣1 μL。經過質譜數據系統檢索(質譜數據庫NTST)，鑒定隴南大紅袍花椒揮發油成分。

3 結果

3.1 線性關系考察

結果表明，檸檬烯進樣濃度在0.16～0.80 mg·mL-1時，響應值與濃度呈良好的線性關系，響應值與濃度的回歸方程為Y= 5×108X-2×107，相關系數為r= 0.999 8；芳樟醇在0.32～0.96 mg·mL-1范圍內呈良好的線性關系，響應值與濃度的回歸方程為：Y= 4×108X-5×108相關系數為r=0.999 5。

3.2 樣品含量測定

圖1 甘肅隴南大紅袍花椒揮發油氣相色圖譜

圖2 檸檬烯氣相色譜圖

圖3 芳樟醇氣相色譜圖

Group檸檬烯芳樟醇Sample 10.35 0.95 Sample 20.37 1.03 Sample 30.36 0.97 Sample 40.41 1.14 Sample 50.39 0.89 Sample 60.33 1.39 Sample 70.40 1.23 Sample 80.42 1.29 Sample 90.32 0.87 Sample 100.44 0.89 Sample 110.34 1.21 Sample 120.32 0.95

取12批甘肅隴南大紅袍花椒經粉碎過篩后，分別按“2.3.2”項下方法測定檸檬烯、芳樟醇的含量。結果表明甘肅隴南大紅袍花椒中芳樟醇含量(1.07%±0.16%)略高于檸檬烯含量(0.37%±0.04%)。

3.3 方法學考察

3.3.1 重復性試驗 測得甘肅隴南大紅袍花椒中芳樟醇含量均值為1.03%，RSD為0.08%；檸檬烯含量均值為0.37%，RSD為0.03%結果表明重復性良好。

3.3.2 穩定性試驗 結果芳樟醇含量的RSD=0.79%，檸檬烯含量的RSD=0.81%，穩定性良好。

3.4 成分鑒定

圖4 檸檬烯質譜圖

圖5 芳樟醇質譜圖

經過質譜數據系統檢索(質譜數據庫NTST)，鑒定隴南大紅袍花椒揮發油成分為檸檬烯、芳樟醇。

4 結論

根據隴南大紅袍花椒揮發油成分為檸檬烯、芳樟醇的測定結果發現，其芳樟醇含量略高于檸檬烯，且芳樟醇、檸檬烯含量較高，可以用來快速、簡便控制其花椒質量。花椒揮發油用正己烷稀釋較甲醇、乙醇稀釋效果好，其測定峰在此條件下分離度、峰形好。芳樟醇是花椒中重要的香氣成分之一，具有抗菌、鎮靜、除臭、殺蟲等功效，檸檬烯含量青花椒中為0.013%，紅花椒中為0.014%；芳樟醇的含量在青花椒中為0.072%，紅花椒中為0.008%[11]，從這兩個指標來看，隴南大紅袍花椒中的檸檬烯、芳樟醇含量均高于紅花椒和青花椒，這可能是引起隴南大紅袍花椒與青花椒、紅花椒香味差異的重要原因。