表皮松解性掌跖角化病一家系KRT9基因突變檢測

倪曉靜 周乃慧 王建波 李 敏

表皮松解性掌跖角化病(epidermolytic palmoplantar keratoderma，EPPK，OMIM:144200)是一種少見的常染色體顯性遺傳性皮膚病，由V?rner于1901年首先描述，故又稱V?rner型掌跖角化病[1]。本病主要臨床表現(xiàn)為局限于掌跖部位的彌漫性、斑塊狀、有清晰紅色邊緣的角質(zhì)增厚，表面光滑，顏色偏黃。常在出生后3個(gè)月至1年內(nèi)發(fā)病[2]。Reis等首次將EPPK的致病基因定位在染色體17q12-q21上，隨后在角蛋白9基因(keratin 9 gene，KRT9)中檢測到一點(diǎn)突變R162W，確定該病的致病基因[3,4]。現(xiàn)報(bào)道一例EPPK，并分析其KRT9基因的突變情況。

1 先證者資料

患者，女，41歲。掌跖皮膚增厚40余年。患者出生后約4個(gè)月掌跖部開始出現(xiàn)彌漫性角化，隨著年齡增加掌跖彌漫性角化過度明顯加重，僅局限于掌跖部位，邊緣清楚，色澤淡黃，表面光滑。夏季較輕，冬季干燥明顯，足底常脫屑、皸裂。體格檢查：一般情況好， 各系統(tǒng)檢査未發(fā)現(xiàn)明顯異常。皮膚科檢查：掌跖部可見彌漫性角化增厚組織，淡黃色，邊界清，表面干燥、質(zhì)硬，雙足底有少量脫屑和皸裂(圖1a、b)。毛發(fā)、牙齒、甲及口腔粘膜未見明顯異常。實(shí)驗(yàn)室檢查：足底真菌鏡檢陰性，血、尿、糞常規(guī)及肝腎功能未見明顯異常。患者拒絕行組織病理學(xué)檢查。

2 家系調(diào)查

患者母親有類似癥狀，父親正常，父母非近親結(jié)婚。家族三代共有患者6例，男2例，女4例，均為出生后3～6個(gè)月發(fā)病，皮損類似，均表現(xiàn)為掌跖彌漫性角化過度。目前未發(fā)病者子代均正常，發(fā)病無性別差異，無隔代遺傳現(xiàn)象，符合常染色體顯性遺傳模式(圖2)。

3 KRT9基因檢測

3.1 實(shí)驗(yàn)方法 在簽署書面知情同意書后，對(duì)整個(gè)家系14個(gè)家庭成員(6例患者，8名正常)進(jìn)行血樣采集。應(yīng)用北京Tiangen公司TIANamp Blood基因組DNA提取試劑盒提取全血基因組DNA。同樣方法提取100名無親緣關(guān)系的健康對(duì)照個(gè)體基因組DNA作為對(duì)照。通過因特網(wǎng)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查取KRT9 mRNA序列，經(jīng)BLAST比對(duì)得到該基因的基因組序列 (http://www.genome.UCSC.edu/)，應(yīng)用 Primer 3.0設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)KRT9所有外顯子及其側(cè)翼序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min后，94℃變性45s，56℃～60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。72℃延伸10 min。2%的瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后直接在 ABI3730全自動(dòng)DNA測序儀(美國Applied Biosystems)上進(jìn)行雙向測序，各測序結(jié)果采用BioEdit軟件比對(duì)分析結(jié)果。用SIFT和Polyphen-2軟件預(yù)測c.482A>G (p.Asn161Ser) 突變位點(diǎn)的有害性。

3.2 結(jié)果 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果經(jīng)BioEdit軟件比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)，該家系6例患者的KRT9基因第482位堿基腺嘌呤(A)突變?yōu)轼B嘌呤(G)，家系中8名表型正常者及100名正常對(duì)照中均未發(fā)現(xiàn)此突變(圖3a、b)。SIFT軟件對(duì)p.Asn161Ser突變的功能預(yù)測結(jié)果為有害(deleterious)，其score為-4.668。Polyphen-2軟件的預(yù)測結(jié)果為可能有害(probably damaging)，p.Asn161Ser突變的score為1.00。提示SIFT和Polyphen-2軟件預(yù)測p.Asn161Ser突變均為有害變異位點(diǎn)，可能影響其蛋白質(zhì)功能。

圖1 a：雙手掌彌漫性淡黃色角化增厚組織；b：雙足掌彌漫性淡黃色角化增厚組織，上覆較多鱗屑，局部皸裂圖2 家系圖，箭頭所指為先證者

a：正常人；b：患者，箭頭示c.482A>G(p.Asn161Ser)突變

4 討論

EPPK是一種常染色體顯性遺傳病，均在出生后3個(gè)月至1年內(nèi)發(fā)病，通常在3～4歲表現(xiàn)完全，以掌跖部的皮膚彌漫性角化為主要臨床特征。本病通常不累及掌跖部伸側(cè)，部分患者伴發(fā)指節(jié)墊、甲改變(甲板增厚、渾濁)和手指畸形等臨床表現(xiàn)，可伴發(fā)癌癥、聽力喪失及心力衰竭等危害嚴(yán)重的疾病。本研究中，先證者具有典型的臨床表現(xiàn)，結(jié)合其家系符合常染色體顯性遺傳模式，EPPK基本可診斷，基因突變分析進(jìn)一步明確診斷。

近些年的遺傳及分子學(xué)研究表明，EPPK是由編碼角蛋白9的基因KRT9發(fā)生突變所致。KRT9是一種Ⅰ型角蛋白，僅表達(dá)于掌跖部表皮的棘突層。角蛋白基因的突變常會(huì)引起各種表皮和非表皮的細(xì)胞脆性問題[5,6]。突變的角蛋白纖維削弱了細(xì)胞骨架，當(dāng)細(xì)胞遭受物理創(chuàng)傷時(shí)，導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞的結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)崩潰。KRT9基因突變熱區(qū)位于桿狀功能域lA區(qū)前端的15個(gè)氨基酸和2B區(qū)末端的10～11個(gè)氨基酸，這兩個(gè)區(qū)域是兩段在進(jìn)化上高度保守的氨基酸序列：螺旋起始基序和螺旋終末基序[7,8]。迄今，在不同的EPPK家系中檢測到至少32種不同的KRT9基因突變位點(diǎn)，其中25種發(fā)生在1A區(qū)，6種發(fā)生在2B區(qū)[9-12]。2013年，F(xiàn)uchs-Telem等[13]報(bào)道一新發(fā)突變p.[Leu11Val; Leu11_Gln172del]，該突變位點(diǎn)除了涉及1A區(qū)，還累及KRT9非螺旋區(qū)的頭部，打破了學(xué)者們常規(guī)認(rèn)為KRT9基因突變位點(diǎn)通常在1A和2B區(qū)域的觀念。KRT9基因1A區(qū)的突變p.R163W是EPPK中最常見的突變類型，約占31.71%，在我國的發(fā)生頻率約為31.03%[9]。目前EPPK仍沒有明確的基因型-表型相關(guān)性分析，可見本病的發(fā)病因素或許比人類迄今所了解的更復(fù)雜。

本家系中患者的KRT9基因第482位堿基腺嘌呤(A)突變?yōu)轼B嘌呤(G)，導(dǎo)致1號(hào)外顯子中第161位密碼子由AAT→AGT，即正常的天冬酰胺(Asparagine，Asn)由絲氨酸(Serine，Ser)取代，即c.482A>G(p.Asn161Ser)。此突變位點(diǎn)既往國內(nèi)有報(bào)道[14,15]，當(dāng)時(shí)報(bào)道為“KRT9基因第1外顯子第160位密碼子發(fā)生AAT→AGT的突變，導(dǎo)致第160位的天門冬氨酸被絲氨酸取代(N160S)”。新版本的KRT9基因序列發(fā)表于2005年4月23日，突變R162W更換為R163W[gi:55956898]，故此突變位點(diǎn)最新的標(biāo)注為c.482A>G(p.Asn161Ser)。此外，既往文中的天門冬氨酸應(yīng)更改為天冬酰胺。本家系突變位點(diǎn)c.482A>G(p.Asn161Ser)處于桿狀功能域螺旋起始基序，桿狀結(jié)構(gòu)域?yàn)棣?螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)，突變后可能引起氨基酸理化性質(zhì)的改變，造成角蛋白亞單位受損，從而破壞角蛋白中間絲聚合的穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致本家系患者掌跖角化過度的發(fā)生。另外 SIFT和Polyphen-2軟件也同時(shí)預(yù)測c.482A>G(p.Asn161Ser)突變?yōu)橛泻ψ儺愇稽c(diǎn)，進(jìn)一步印證該突變可能影響蛋白質(zhì)功能。此突變位點(diǎn)也為熱點(diǎn)突變，目前所報(bào)道的均發(fā)生在亞洲國家，日本、韓國及國內(nèi)均有家系報(bào)道[6]。國內(nèi)報(bào)道的家系中患者有伴發(fā)指節(jié)墊、甲改變和手指畸形等臨床表現(xiàn)[14,15]。本家系患者中均無以上病變，以上病變是否與KRT9基因突變有關(guān)及其致病機(jī)理如何還有待進(jìn)一步研究。

總之，EPPK根據(jù)其臨床表現(xiàn)結(jié)合基因突變分析即可確診，但具體的發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前治療方法有局部對(duì)癥治療、口服維A酸類藥物、CO2激光療法及分層皮片移植術(shù)等，但療效均不佳，本病理論上仍寄希望于基因治療。目前的病例報(bào)道、基因測序及功能研究等進(jìn)一步為該病的基因診斷、遺傳咨詢和基因治療提供理論基礎(chǔ)。