魚肉肌紅蛋白的呈色機理及其在熱加工中對肉色的影響

1.浙江國際海運職業技術學院 浙江舟山 316021 2.浙江工商大學水產品加工研究所 浙江杭州 310035 3.浙江省水產品加工技術研究聯合重點實驗室 浙江杭州 310035

水產品是人們日常飲食中不可缺少的重要部分，尤其是魚類，由于肉質鮮嫩，營養豐富，深受消費者的喜愛。魚肉的顏色是評價魚肉品質的重要指標之一。肉及肉制品顏色的變化是一個較為復雜的話題，包括了眾多的影響因素，比如肉的來源，屠宰前和屠宰時的條件，肌肉的理化成分以及肉品的加工、包裝、物流、貯藏和消費條件。原因不盡相同，但歸根結底的基本影響因素始終為肌肉中呈色物質—血紅素蛋白質的變化[1]。

魚肉中的血紅素蛋白質包括肌紅蛋白和血紅蛋白，其中，血紅蛋白主要分布在魚的內臟和血管中，在加工貯藏中易流失；肌紅蛋白分布在肌肉細胞中，是魚肉(尤其是金槍魚屬和一些暗色肉魚類)的主要呈色物質，據報道[2]，黃鰭金槍魚暗色肉中的Mb含量為5.3～24.4mg/g，而其血液中的Hb含量也只為0.5～3.8mg/g，故肌紅蛋白的變化直接影響肉色的變化。肌紅蛋白的化學狀態受諸多因素影響，如溫度、pH值、脂肪氧化、氧分壓、離子強度等[3]。

除了生鮮、冷凍魚的消費，部分魚肉加工成半成品、熟制品進行銷售流通，如柴魚、蒸煮后進行軟包裝的魚片、魚柳，魚肉罐頭等。在一些熱加工中，魚肉顏色會發生較大的變化。

本文通過闡述肌紅蛋白的基本理化性質、呈色機理和常用檢測方法，對影響肌紅蛋白氧化的因素、肌紅蛋白在熱加工中所引起的肉色變化及其原因進行了分析和討論，旨在為魚肉熱加工中的護色工藝提供參考依據。

1 肌紅蛋白的理化性質及呈色原理

1.1 肌紅蛋白

肌紅蛋白(Myoglobin，Mb)是一種存在于動物肌肉組織細胞中的球狀蛋白質，相對分子量為15 000～17 000Da，由一條多肽(球蛋白，Globin)和一個血紅素(Heme，Hemin)構成，為水溶性蛋白質。Mb在不同條件下具有多種結構，其中脫氧肌紅蛋白(Deomyoglobin，DeoMb)、氧合肌紅蛋白(Oxymyoglobin，OxyMb)和高鐵肌紅蛋白(Metmyoglobin，MetMb)為常見的三種衍生物。

圖a為脫氧肌紅蛋白結構；圖b為氧合肌紅蛋白結構；圖c為高鐵肌紅蛋白結構圖1 三種肌紅蛋白衍生物的結構Fig. 1 The structure of myoglobin and the different coordination on porphyrin ring

血紅素是卟啉環與鐵原子的絡合物，是肌紅蛋白呈色的關鍵結構(圖1)。中心鐵原子具有六個配位鍵，通常形成一個正八面體，其中四個與卟啉環的四個吡咯環氮配位，第五位與多肽鏈中組氨酸的咪唑基配位，第六配位鍵根據配合物的不同分別形成脫氧肌紅蛋白、高鐵肌紅蛋白(與水分子結合，圖1a、圖1c)和氧合肌紅蛋白(與氧分子結合，圖1b)。DeoMb和OxyMb中的鐵原子為還原態(II)，血紅素稱為亞鐵血紅素(Heme)；MetMb中的鐵原子為氧化態(III)，相應的血紅素稱為高鐵血紅素(Hemin)。

1.2 肌紅蛋白的呈色原理

肌肉顏色的變化與Mb的化學狀態是緊密相關的。圖2顯示了各種肌紅蛋白衍生物之間的相互轉變。在活魚或剛翻肚皮魚的肌肉中，Mb主要以還原態(II)的形式存在，魚肉呈鮮紅色(粉紅色)或深紫色(高濃度DeoMb呈深紫色，常見于大型魚體的深層魚肉中)。其中，OxyMb和DeoMb會發生相互轉變，DeoMb轉變OxyMb的過程稱為氧合氧化。魚死后，在貯藏過程中，Mb(II)則逐漸轉變為MetMb(III)，使魚肉呈褐色，這個過程為血紅素蛋白質的自動氧化(Autoxidation)。這種顏色的變化，可通過Mb各種衍生物特有的吸收光譜進行測定。另外，Mb的自動氧化還會產生一些超氧陰離子自由基(O2·-和·OOH)，這些物質會進一步歧化生成H2O2[4]。MetMb在H2O2等過氧化物的作用下進一步氧化，生成具有極強促氧化能力的超鐵肌紅蛋白自由基(Perferrylmyoglobin，Mb-Fe IV)和超鐵肌紅蛋白(Ferrylmyoglobin，Mb-Fe IV)。但這種肌紅蛋白(Fe IV)由于生成量極少且性質活潑不穩定，容易發生自動還原生成MetMb[5]。

圖2 各種肌紅蛋白衍生物之間的相互轉變Fig. 2 Dynamic Conversion between the different myoglobin

魚在貯藏加工中，大量的OxyMb轉變為MetMb，肉色逐漸褐變。研究表明[6,7]MetMb的結構比OxyMb不穩定，血紅素與肽鏈的結合力遠弱于OxyMb[8]，故其卟啉環更易發生裂解而造成血紅素和鐵離子的丟失，這是在保藏期長或者一些加工程度高的魚肉中出現褪色現象的原因之一。

2 魚肉Mb常用檢測方法

根據魚種類和肌肉類型的不同，肌紅蛋白易在貯藏和加工期間易發生變化或流失，故檢測Mb含量對評價肉色有重要作用。DeoMb、OxyMb、MetMb在紫外可見區域都具有特征吸收光譜，魚類的Mb在可見光波長內的吸收光譜基本相同，在410nm附近有強吸收峰，在500～750nm范圍具有若干個弱吸收峰。根據Mb的特征吸收光譜，可應用朗伯-比爾定律(A=εbc)來測定Mb的含量，但不同來源的Mb吸收光譜有所差異。根據前人的研究[9～12]，幾乎所有的計算公式(計算禽畜和魚類等動物肌肉中的MB含量)是基于馬Mb的消光系數，大多采用其近似公式，故有一定的局限性。

由于不同Mb衍生物的顏色不同，Mb含量及三種衍生物的比例，尤其是MetMb的比例對魚肉顏色有較大的影響，故三種Mb衍生物發的百分含量可作為肉色的判斷標準之一。近些年涉及Mb衍生物含量測定的研究中，應用較多的是以馬心Mb的吸收光譜為基礎所建立的計算方程[12]。Matsuura(1955)[13]和Brown(1962)[14]等人報道大目金槍魚和藍鰭金槍魚的Mb衍生物具有相同的最大吸收波長和最小吸收波長，并比較了幾種魚類Mb的吸收光譜。Chotika(2011)等人[15]以大眼金槍魚三種Mb衍生物的吸收光譜為基礎，建立了金槍魚Mb濃度的計算方程，該方程在一些魚類肉色和魚類Mb的研究中應用較多，其它魚類的計算方法還未被明確報道過。

近期，張同剛(2018)等人[16]報道采用于拉曼光譜法來無損檢測冷鮮牛肉中肌紅蛋白相對含量，并得到相關的推導公式，具有一定的可行性。該方法在魚類Mb相對含量的檢測應用上還未見報道。

3 影響Mb穩定性的因素

魚肉在加工貯藏中，肉色主要由Mb的性質決定，Mb穩定性的影響因素包括Mb的溶解度，熱穩定性、自動氧化性質及促氧化因素、高鐵肌紅蛋白還原酶系等。

3.1 Mb的溶解度

Mb是水溶性蛋白質，研究表明即使反復多次用水抽提暗色肉的Mb，也不能使魚肉完全脫色，這是由于穩定的肌原纖維蛋白質在機械操作下發生變性，包裹住了Mb，以致其難于溶出[17]。所以大部分魚肉在加工中，無法消除因Mb變化所引起的肉色變化。

3.2 Mb的熱穩定性

Mb穩定性因魚的種類和衍生物類型而異，一般魚類Mb比哺乳動物類Mb的熱穩定性差，尤其是MetMb，容易發生熱變性。此外，Ledward(1971)[18]等人已經證實Mb在肌肉中的熱穩定性比在其肌肉相同pH值和離子強度的溶液中的熱穩定性要低得多。但沙丁魚的MetMb在某些條件下，對熱是極其穩定的，這在沙丁魚的加工上是值得注意的。

3.3 Mb的自動氧化性質及促氧化因素

魚類Mb的自動氧化速度比其他來源的Mb快得多，比如同一條件下是哺乳類動物Mb氧化速度的2.5～4倍。Mb氧化一般發生在Mb結構中的血紅素鐵部分，珠蛋白部分幾乎不發生同步氧化。低pH值，高鹽濃度、非血紅素鐵[19]、脂質氧化[20～22]等因素都能明顯促進Mb的氧化。此外，有較多研究[23～25]證明脂質氧化和Mb氧化存在密切聯系，脂質氧化產生的初、次級代謝產物具有促進Mb氧化的作用[26,27]，進而加速肉色褐變或褪色。此外，脂質氧化對不同來源的Mb的促氧化作用有所差異[28]。

3.4 高鐵肌紅蛋白還原酶系

在活體魚的血紅細胞中存在高鐵肌紅蛋白還原酶系(MetMb還原酶系)，能不斷將MetMb還原，使其維持在2%～3%左右[29]。近年來關于MetMb還原酶對肉色穩定性作用的研究中，由于Mb的來源不同，實驗方法有差異，兩者的相關性還存在一些爭議[2]。松浦等人(1962)[30]認為藍鰭金槍魚中的MetMb還原酶與其肉色穩定性呈正相關，且是維持魚肉鮮紅色的主要原因。肌肉中存在豐富的毛細血管，其中殘留的還原酶就延緩了肉色的褐變。不過，隨著時間的延長和加熱溫度的升高，還原酶系的活性將會逐漸減弱，直至完全消失。

4 熱加工中Mb及肉色的變化

加熱后的魚肉會呈現出白、粉紅、紅、暗褐色等各種顏色。一些Mb含量較少的魚加熱后一般呈白色、淺粉紅色或淺褐色，Mb含量較高的紅肉魚(鮐魚、金槍魚、鰹魚、秋刀魚、鯖魚、沙丁魚等)則多呈紅或暗褐色。熱處理使Mb的珠蛋白變性，也使原本與血紅素鐵第六配位鍵結合的水分子被肉中微量的尼克酰胺等堿基所取代，此時血紅素轉變為血色原(Hemochrome,Fe2+)。小泉[31]以金槍魚魚肉的Mb為原料進行了研究，認為金槍魚中尼克酰胺含量量相對較少，還不夠使全部的Mb變為血色原。當加熱溫度較低或加熱時間較短時，Mb幾乎不變性，若魚肉中尼克酰胺等堿基的含量較高，Mb則大部分變為血色原，使肉的顏色變為紅色或粉紅色。當魚肉中尼克酰胺等堿基含量較低時，生成的血色原不穩定，立刻被氧化成高鐵血色原(Hemichrome，Fe3+)，使肉呈現棕褐色。此外，Ledward(1971)[18]認為在低于Mb熱變性的溫度下，Mb也會發生構象的改變，使結構中的血紅素暴露，并與其它已產生變性的蛋白質結合。比如，側鏈帶有咪唑基團的變性蛋白質會與血紅素中的鐵原子發生螯合并最終取代珠蛋白，所以他認為熟肉中的肌紅蛋白是一些血紅素和幾種蛋白質相結合的混合物。

Mb的氧化還原狀態會也影響魚肉加熱后的顏色。一般來說，DeoMb比OxyMb和MetMb具有更好的熱穩定性[32]。當魚肉的MetMb含量較高時，加熱后高鐵血色原所占比例高，肉呈暗褐色。研究表明[33]，當牛肉中OxyMb和MetMb比例較高時，加熱后更容易提前出現進一步的褐變(相比于DeoMb比例較高的牛肉)；提高加熱溫度和延長加熱時間會降低牛肉的紅度值[34]。該研究結果這對Mb含量較高的紅肉魚的熱加工有一定的借鑒作用。

有研究[25]指出脂質氧化的初級代謝產物(過氧化物)能加速Mb結構中卟啉環的裂解。加熱能加速脂質氧化及降低Mb結構的穩定性，使蒸煮鰹魚在貯存過程中發生嚴重的褪色現象[35]。

前文提到MetMb還原酶系能有效降低MetMb的含量，該酶在50℃左右就失去活性了[32]，但肌肉中存在著一個NADH-MetMb減少系統，即使是在60℃左右這樣的高溫下，也能使MetMb產生類似于OxyMb的鮮紅色[36]。當肉的pH值較低且加熱溫度相對較低時，已變性Mb中的鐵離子很可能還保持2價狀態，從而呈現粉色或紅色，而不是常見的灰色或棕褐色[37]。

肉類的包裝方式對加熱后的顏色變化也有重要影響。Torngren(2003)[38]發現將采用高濃度氧氣MAP包裝的牛排加熱時，其表示熟肉的棕褐色會提前出現。而一氧化碳MAP包裝的肉類在加熱時更能保持肉原有的粉紅色[39]，這是由于CO-Mb的熱穩定性較高(高于DeoMb)。John(2004)和Seyfert(2004)等人[40～42]對MAP包裝氣體比例含量等因素對肉類加熱后顏色變化的影響進行了研究。

此外，其他一些因素也會影響加熱后的肉色。比如長鰭金槍魚罐頭中的肉一般呈粉紅色，但當原料肉中含有較多的氧化三甲胺時，蒸煮后的肉容易呈現青綠色。

綜上所述，熱處理后Mb結構的變化與肉色有密切聯系，原料種類(尼克酰胺等堿基的含量)、原料的新鮮度(MetMb與變性Mb的比例)、脂質氧化引起的Mb結構變化等因素對加熱后的肉色有重要影響，此外加熱溫度、pH值、包裝方式、氧化產物等其他因素在魚肉熱加工中應予以考慮。

5 小結

魚肉熱加工重要的是魚肉肌紅蛋白含量較一般的畜肉類低，但在魚肉的加工貯藏中，Mb的變化也會引起肉色較大的改變。加熱是一種較常見傳統的肉品加工方式，熱處理后Mb結構的變化與肉色有密切聯系，魚肉種類、原料的新鮮度、脂質氧化程度、加熱溫度、pH值、包裝方式、氧化產物等其他因素對加熱后的肉色有重要影響。故要根據魚肉肌紅蛋白的特性，以及產品加工及貯藏方式的特點，充分考慮熱加工中肌紅蛋白變化引起的感官品質變化，合理改進加工工藝條件，以盡量降低由肌紅蛋白改變引起的質量下降。