紅樹林植物來源內生真菌構巢曲霉MA143次級代謝產物的分離與結構鑒定

冷 懿

（北京林業大學，北京100083）

天然產物在現代疾病治療與防治中依然發揮著重要作用，一直是許多新藥制劑或藥物先導化合物的重要來源[1]。如今，一些治療重大疾病,如癌癥、感染性疾病、代謝紊亂、免疫缺陷的藥物依然主要來源于天然產物或其類似物[1-2]。從天然產物的來源來看，微生物次生代謝產物是天然藥物或先導化合物的重要來源。微生物能夠產生結構復雜多樣、活性廣泛顯著的次生代謝產物，如臨床上使用的阿司匹林、環洛伐他汀、紫杉醇、嗎啡等，成為人們進行新藥研發的重要研究對象[3](如圖1-2)。本文以紅樹林植物來源內生真菌構巢曲霉MA143為研究對象，對其ICI培養基發酵粗提物的化學成分進行初步研究,以期從紅樹林植物中分離得到具有顯著生物活性的新化合物，用于如抗腫瘤、抗真菌等醫藥用途。

1 材料與方法

1.1 研究對象——構巢曲霉MA143

構巢曲霉（Aspergillus nidulans，也稱為 Emericella nidulans，構巢裸胞殼）（如圖3）通常為單倍體，但能誘導為異核體或二倍體，產生有性和無性孢子，而其他大部分曲霉是無性的。構巢曲霉是遺傳學和生物化學研究得最廣泛的微生物之一，已經成為真核生物細胞生物學上一個重要模式生物，可表達哺乳動物基因。構巢曲霉是工業和醫學上使用較多的曲霉菌如黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉（A.oryzae）、黃曲霉（A.flavus）和煙曲霉（A.fumigatus）等的近緣種。構巢曲霉基因組約31 Mb是目前NCBI上公開發表的47種真菌的基因組序列之一。研究構巢曲霉的次生代謝產物具有重要意義，這將有助于了解構巢曲霉的生物學特性，還能促進疫苗和藥物的研制開發。

圖1 天然產物是醫藥發展的重要動力Figure1 Natural products is the important driving force of the development of the medicine

圖2 紅樹林內生真菌活性代謝產物研究進展Figure2 Mangrove endophytic fungi active metabolites were reviewed

圖3 構巢曲霉MA143Figure3 Structure aspergillus MA143 nest

1.2 ICI培養基配方

表1 ICI培養基配方Table1 ICI medium formula

1.3 培養方式

自然光照，靜置發酵30天。

1.4 主要分離方法原理及操作[4-7]

1.4.1 硅膠柱層析

分離原理：根據硅膠對物質的吸附力不同而達到分離目的。正常情況下，極性大的物質容易被硅膠吸附，極性較小的物質不易被硅膠吸附，適用于分離極性小的化合物。

其主要操作步驟如下：

拌樣：用最少量的低沸點合適有機溶劑（如二氯化碳）將待分離的樣品充分溶解，與能充分吸附該樣品量的100～200目硅膠攪拌均勻，揮干溶劑，得到柱層析所用樣品；

裝柱：根據拌樣量硅膠量的多少，選擇直徑、長度適當的玻璃柱，裝入適量300～400目的硅膠(使拌樣的硅膠高度與固定相填料的高度比在1：15左右)，用真空泵抽勻、抽實；

上樣：將拌樣得到的硅膠樣品在層析柱上表面均勻鋪撒，再用真空泵抽勻、抽實，然后在樣品上表面添加保護層硅膠和脫脂棉；

洗脫：根據TLC薄層板中化合物的比移值（Rf值）不同，所要得到的化合物的Rf值大小，選擇適當的洗脫劑，按極性從小到大的順序，選擇不同的梯度連續洗脫，收集洗脫劑組分；

回收組分的處理：通過薄層層析分析法顯色后，把含有相同Rf值并且顯色相同的組分合并在一起。合并到一起的各個組分分別用旋轉蒸發儀于40℃左右減壓濃縮，得到濃縮浸膏或干粉顆粒。

1.4.2 凝膠柱層析（Sephadex LH-20）

分離原理：凝膠柱層析也叫分子篩過濾，它是利用分子篩效應過濾分離物質的方法，其所用載體，如Sephadex-LH-20，具有三維的網狀結構。當在有機溶劑中充分溶脹后裝入色譜柱中，加入樣品混合物，用同一溶劑洗脫時，由于凝膠網孔半徑的限制，大分子物質不能進入到凝膠顆粒內部網孔中，在顆粒間隙流動，隨著洗脫劑一起從柱底流出，小分子化合物因為能夠進入凝膠顆粒內部，而后流出。從而樣品按分子量從大到小先后流出凝膠色譜柱。實驗操作步驟如下：

裝柱：本實驗所用的凝膠為葡聚糖凝膠Sephadex LH-20。凝膠在使用前用甲醇充分溶漲，裝柱完成后再用3倍柱體積的洗脫液置換；

上樣：將濃縮后的樣品用盡量少的溶劑充分溶解(樣品用初始洗脫劑溶解)，上樣結束后，使樣品全部進入柱內再用盡量少的洗脫液清洗漏斗及柱壁，

洗脫：待樣品完全進入柱材料中時，緩緩加入洗脫液(甲醇，甲醇與二氯甲烷的混合溶劑)，調至合適的流速 (流速與柱長度和直徑有關系)，常壓過柱；

回收組分的處理：通過薄層層析分析法顯色后，把含有相同Rf值并且顯色相同的組分合并在一起。合并到一起的各個組分分別用旋轉蒸發儀于40℃左右減壓濃縮，得到濃縮浸膏或干粉顆粒。

1.4.3 反相柱層析

分離原理：反相柱層析其固定相為非極性基團，如十八烷基（C18）、辛烷基（C8）、甲基與苯基等，流動相用強極性溶劑，如水、醇、乙腈或者無機鹽緩沖溶劑，最常用的是不同比例的水和甲醇配制的混合溶劑。極性大的組分先流出，極性小的組分后流出，恰好與正向法相反，故稱反向層析。本法適合于小分子物質的分離純化。實驗操作步驟如下：

裝柱：本實驗所用的反相柱層析填料為RP-C18。選擇直徑、長度適當的玻璃層析柱，將適量RP-C18填料和起始梯度的洗脫劑混懸(甲醇)后進行裝填；

平衡層析柱：用起始梯度的洗脫劑(不同濃度的甲醇或丙酮)平衡柱子；

上樣：將樣品用適量起始梯度的洗脫劑完全溶解，用漏斗過濾后，液體上樣；

洗脫：根據TLC薄層板中化合物的比移值不同，所要得到的化合物的比移值大小，選擇適當的洗脫劑，按極性從大到小的順序進行洗脫；

回收組分的處理：通過薄層層析法顯色后，把含有相同Rf值并且顯色相同的組分合并在一起。合并到一起的各個組分分別用旋轉蒸發儀于40℃左右減壓濃縮，得到濃縮浸膏或干粉顆粒。

1.5 實驗過程

1.5.1 實驗流程圖（如圖4）

1.5.2 發酵物的處理：

加入乙酸乙酯浸沒菌絲體，72小時后，過濾，將濾渣用玻璃棒攪碎，再加入乙酸乙酯浸泡并超聲20 min，然后過濾。將乙酸乙酯相合并蒸干，得到粗提物浸膏4.6g。（如圖5）為粗提物HPLC譜圖分析。

圖4 實驗流程圖Figure4 Flow chart of the experiment

圖5 粗提物HPLC譜圖分析Figure5 Crude extractings HPLC chromatogram analysis

1.5.3 代謝產物的分離

菌株發酵浸膏通過真空柱層析（VLC）進行極性分段。用100～200目硅膠拌樣，200～300目硅膠裝柱子，真空泵抽緊后上樣，用不同比例的、極性從小到大的石油醚-乙酸乙酯和氯仿-甲醇溶液進行層析洗脫。收集到的各個組分，再經反復的正相、反相色譜層析和重結晶等方法，分離純化得到單體化合物。綜合運用現代波譜技術 (旋光、UV、1H-NMR、13CNMR、DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC) 以及與標準品或文獻比對，共鑒定了3個化合物的結構。

2 結果與分析

試驗結果見圖5-圖14

化合物1的1H和13C譜數據（如圖6-7）

圖6 化合物1的氫譜數據Figure6 Compounds 1 h NMR data

圖7 化合物1的碳譜數據Figure7 c NMR data of compounds 1

化合物2的1H和13C譜數據（如圖8-9）：

圖8 化合物2的氫譜數據Figure8 Compounds 2 h NMR data

圖9 化合物2的碳譜數據Figure9 Compounds 2 c NMR data

化合物3的1H和13C譜數據（如圖10-11）：

2.1 化合物1為白色針狀晶體，有亮藍色熒光，茴香醛顯綠色。該化合物的一維核磁數據顯示了氧雜蒽酮（xanthones）的結構特征，經過文獻[8]查閱和比對，發現化合物1與sterigmatocystin（柄曲菌素）的數據幾乎完全一致，因此將其鑒定為sterigmatocystin（如圖12）。該化合物被報道對人肝癌腫瘤細胞株Bel-7402和人大細胞肺癌細胞株NCIH-460有微弱抑制活性。

圖10 化合物3的氫譜數據Figure10 Compounds 3 h NMR data

圖11 化合物3的碳譜數據Figure11 Compounds 3 c NMR data

圖12 化合物1結構Figure12 Compounds 1 structure

2.2 化合物2為橙黃色固體粉末，有黃色熒光，茴香醛顯黃色。該化合物的一維核磁碳譜數據顯示了蒽醌類化合物的結構特征，經過文獻查閱和比對，發現化合物2與Versicolorin A（雜色曲霉素）的數據幾乎完全一致，因此將其鑒定為Versicolorin A（如圖13）。

圖13 化合物2結構Figure13 Compounds 2 structure

2.3 化合物3為紅色固體粉末，有黃色熒光，茴香醛顯血紅色。該化合物的一維核磁碳譜數據顯示了蒽醌類化合物的結構特征，經過文獻查閱和比對，發現化合物3與Averufanin的數據幾乎完全一致，因此將其鑒定為Averufanin（如圖14）。

圖14 化合物3結構Figure14 Compounds 3 structure

3 結論

紅樹林植物開發新型生物活性物質的潛能不可低估[9]，開發其藥物價值,發揮其經濟效益與生態效益，促進海岸居民對其加以保護和種植,具有非常重要的現實意義[10]。