煙草質膜ATPase4基因的克隆、表達載體構建及表達分析

王 靜，彭 雙，胡 圣，卓 維，陳 倩，李立芹，*

(1.四川農業大學 農學院，四川 成都 611130； 2.作物科學國家級實驗教學示范中心，四川 成都 611130)

質膜ATPase是植物細胞膜上非常重要的功能蛋白，被認為是植物細胞代謝和生命活動過程的主宰酶[1]。ATPase在細胞質膜上產生質子梯度，在植物生長發育中調節著許多生理過程[2]。根據位置及功能不同，植物細胞內的ATPase可分為F、P和V三大類型，其中F型ATPase主要分布在線粒體和葉綠體上，P型ATPase分布在質膜上，V型ATPase分布在液泡膜、內質網膜、溶酶體、高爾基體膜上[3]。ATPase在植物生長發育的各個時期以及脅迫響應等多種生理過程中行使重要功能[4]。近年來，關于植物ATPase基因的鑒定和功能研究取得了較大進展，ATPase由大約10個基因的家族編碼[5]。Ayala等[6]研究表明，鹽角草在200 mmol·L-1NaCl處理下，質膜ATPase活性增加。Binzel[7]發現鹽脅迫下，番茄質膜ATPase蛋白表達量增加。也有研究表明，鹽芥幼苗根、葉質膜ATPase活性在100～400 mmol·L-1NaCl處理下較對照均有不同程度的提高[8]。構樹幼苗在100 μmol·L-1NaCl處理下，質膜ATPase活性達到最大值，在150 μmol·L-1NaCl處理下質膜ATPase活性有所降低，但均高于對照[9]。

煙草是我國非常重要的經濟作物之一，而冷害、干旱、鹽堿等非生物環境脅迫嚴重阻礙了煙草的產量與品質[10]。植物細胞中，質膜ATPase在細胞生長發育以及抗逆境脅迫中起著重要的作用[11]。越來越多的質膜ATPase基因被克隆，但煙草中編碼質膜ATPase4蛋白的基因尚未報道。為此，本實驗從煙草中克隆一個質膜ATPase4基因，運用生物信息學方法，預測ATPase4基因編碼蛋白的結構和功能，同時運用qRT-PCR技術，分析該基因在煙草根、莖、葉、花等不同組織中的表達水平以及在低鉀、PEG、高鹽、冷脅迫等逆境下的表達模式，并成功構建ATPase4-pcambia1300過表達載體，以期為進一步研究煙草ATPase4基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

本實驗使用的普通煙草品種為K326。大腸埃希菌感受態DH5α購自VazymeBiotech公司，Trizol試劑、RNA反轉錄試劑盒、高保真R045A酶、SYBR Green Master mix、DNA Ligation Kit 2.0等試劑購自TaKaRa，引物合成與測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料處理

挑選籽粒飽滿、大小一致的煙草種子用75%乙醇消毒1 min，然后20%次氯酸鈉溶液消毒20 min，用無菌水反復清洗5～6次，在超凈工作臺內播種于MS培養基上，每個培養基上播種3排30粒左右，放置在16 h/8 h(光/暗)，25 ℃的光照培養箱中培養15 d后，挑取長勢一致的幼苗，在MS培養基上分別加入KCl(10 mmol·L-1)和5% PEG-6000、NaCl(200 mmol·L-1)進行低鉀、干旱、高鹽處理，同時將培養基放入4 ℃培養箱進行低溫處理。處理0、3、6、12、24 h進行整株取樣。

1.2.2 煙草ATPase4基因的克隆

參考GenBank收錄的絨毛狀煙草ATPase4序列(序列號：XM_016657566.1)，采用同源克隆的方法，用Primer 5.0 軟件設計引物全長引物ATPase4-F和ATPase4-R(表1)。擴增反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸3 min；35個循環。目的片段純化后與pMD19-T載體于16 ℃連接過夜，連接產物轉化大腸埃希菌DH5α感受態。隨后在涂有卡那霉素LB平板上進行篩選，菌落PCR檢測篩選陽性克隆，送至上海生物工程有限公司進行測序。

1.2.3 煙草ATPase4基因的表達分析

根據基因序列，采用Primer Premier 5.0設計熒光定量(qRT-PCR)引物，以煙草18S rRNA為內參，引物序列為18S-F和18S-R(表1)。所有的樣品都設置4個重復，反應結束后，基因相對表達水平用2-△△Ct方法進行計算。

1.2.4 構建過表達載體

重組克隆載體ATPase4-pMD19-T與表達載體pcambia1300用內切酶XbaⅠ和SmaⅠ進行酶切，酶切體系10 μL，含1 μL 10×T緩沖液，1 μL BSA，1 μLXbaⅠ，1 μLSmaⅠ，4 μLNtHA-pMD19-T/pcambia1300載體，2 μL ddH2O。回收純化目的片段后與pcambia1300載體于16 ℃連接過夜，連接產物轉化大腸埃希菌DH5α感受態，隨后在涂有卡那霉素的LB培養基上進行篩選，菌落PCR檢測篩選陽性克隆，搖菌提取質粒，酶切檢測后送至上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.2.5 煙草ATPase4基因生物信息學分析

利用ExPASyProtParamtoo分析ATPase4編碼蛋白的理化性質；DNAMAN軟件分析其編碼蛋白的疏水性；運用IBCP的在線工具SOPMA預測ATPase4二級結構；SWISS-MODEL在線預測ATPase4的三級結構；SMART在線分析ATPase4基因編碼蛋白氨基酸的結構域；NetPhos3.1 Server對蛋白進行磷酸化位點分析；PSORT預測ATPase4的亞細胞定位；Signal-P4.1 Server在線預測蛋白質信號肽；運用MEGA 7軟件，采用鄰近法構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 基因克隆

提取煙草葉片總RNA反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，瓊脂糖電泳結果顯示，在接近3 000 bp的位置上有清晰的條帶(圖1)。將該條帶回收純化后與載體pMD19-T進行連接，轉化大腸埃希菌感受態。將鑒定出的陽性克隆隨機挑選3個進行測序，結果顯示，3個測序結果一致且目的片段大小為2 982 bp。

2.2 ATPase4-pcambia1300過表達載體的檢測

表1引物序列

Table1Primer sequences

引物名稱引物序列Primer namePrimer sequencesATPase4-FATPase4-RATPase4-qFATPase4-qR18SF18SR5′-ATGGCGGATCAGAAGGGAAC-3′5′-CTAAACCGTGTAATGTTGCT-3′5′-AGGATTCGTGGTATTGGTTGGG-3′5′-CTCTTGGCCTGTTCGGCTATTT-3′5′-CCTACGCTCTGTATACATTAGC-3′5′-GTGTTGAGTCAAATTAAGCCGC-3′

M，Marker 5 000 bp；1，ATPase4基因。M， Marker 5 000 bp; 1， ATPase4 gene.圖1 ATPase4的克隆Fig.1 Cloning of ATPase4

將克隆載體ATPase4-pMD19-T與表達載體pcambia1300分別進行酶切，連接轉化E.coli感受態，挑選單菌落進行菌落PCR，篩選構建成功的陽性克隆。利用菌落PCR篩選陽性克隆，1～8為陽性克隆，9為陰性對照(圖2)，陽性克隆在3 000 bp處有清晰的條帶，而陰性對照沒有該條帶。挑取構建成功的陽性克隆，送上海生物有限公司進行測序，測序該目的條帶結果大小為2 982 bp，證明ATPase4-pcambia1300載體構建成功。

2.3 ATPase4基因和蛋白序列分析

2.3.1 ATPase4的理化性質及疏水性分析

ATPase4編碼蛋白的理化性質分析結果表明：含有20種氨基酸，丙氨酸Ala(94，9.8%)、精氨酸(94，9.8%)含量最高，而半胱氨酸Cys(7，0.7%)含量最少。蛋白預測的分子質量為105.88 ku，含有963個核酸殘基，理論等電點pI為6.66，不穩定系數是34.76，該蛋白是一個穩定的蛋白。運用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale)進行的疏水性分析結果顯示，該蛋白總的親水性平均指數為0.136，該蛋白屬于疏水性蛋白(圖3)。

M，Marker 5 000 bp；1～8，ATPase4基因；9，陰性對照。M， Marker 5 000 bp; 1-8， ATPase4 gene PCR product; 9， Negative control.圖2 ATPase4過表達載體構建Fig.2 Construction of ATPase4 overexpression vector

2.3.2 ATPase4的二級、三級結構預測

如圖4所示，利用IBCP(https://npsa-prabi.ibcp.fr)在線工具對ATPase4基因編碼蛋白進行二級結構預測，發現該蛋白中41.12%的氨基酸參與α-螺旋(alpha helix)，21.91%的氨基酸參與延伸鏈(extended strand)，28.56%氨基酸參與無規則卷曲(random coil)，有8.41%的氨基酸參與β-轉角(beta turn)。所以，該蛋白二級結構的最大元件為α-螺旋(alpha helix)。運用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)對ATPase4的三級結構進行分析，用RasTop軟件進行顯示，并將結果與二級結構分析進行對比，兩者結果一致。

圖3 ATPase4疏水區預測Fig.3 Prediction of hydrophobic region of ATPase4

A，二級結構；B，三級結構。A， Secondary structure; B， Tertiary structure.圖4 ATPase4的結構預測Fig.4 Prediction of the structure of ATPase4

2.3.3ATPase4基因編碼蛋白亞細胞定位及信號肽分析

利用PSORT(http://psort1.hgc.jp/form.html)預測的ATPase4亞細胞定位；Signal-P4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測蛋白信號肽。結果表明，該基因在質膜上占0.800，在高爾基體膜占0.400，在內質網膜上占0.300，在微體(過氧化物酶體)中占0.300，因此，預測該基因可能定位在質膜上。根據神經網絡方法或隱馬氏模型方法預測信號肽位置及切割位點，利用mean-score來判斷是否為分泌蛋白(圖5)，預測結果顯示score值為0.093，小于0.5，說明該基因編碼的蛋白不是分泌蛋白，所以不存在信號肽。

2.3.4 ATPase4編碼蛋白磷酸化位點分析

利用NetPhos3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)進行分析蛋白磷酸化位點，NetPhos3.1是利用神經網絡預測真核細胞蛋白質中絲氨酸(Serine)、蘇氨酸(Threonine)和酪氨酸(Tyrosine)磷酸化位點工具，NetPhos中的內設閾值為0.5，高于0.5則被認為是可能的磷酸化位點。NetPhos對ATPase4基因編碼蛋白進行磷酸化位點分析顯示(圖6)，ATPase4基因編碼蛋白中含有36個絲氨酸(Ser)磷酸化位點、23個蘇氨酸(Thr)磷酸化位點、6個酪氨酸(Tyr)磷酸化位點，說明該基因編碼的蛋白能被激酶所磷酸化，進而參與逆境脅迫。

圖5 ATPase4的信號肽預測Fig.5 Prediction of signal peptide of ATPase4

圖6 ATPase4的磷酸化位點預測Fig.6 Prediction of phosphorylation site of ATPase4

2.3.5 ATPase4同源性分析

將ATPase4氨基酸序列進行Blastp序列比對，為進一步分析ATPase4蛋白與其他物種內質膜ATPase家族的蛋白相關性，將ATPase4氨基酸序列與其他物種進行比對(圖7)，結果顯示，該煙草質膜ATPase4蛋白與其他物種質膜ATPase4蛋白序列之間具有高度的保守性。采用鄰近法與不同物種做出系統進化樹表明，煙草質膜ATPase4氨基酸序列與美花煙草和辣椒質膜ATPase4具有較高氨基酸序列相似性，分別為98%、94%；與榴蓮和南瓜質膜ATPase4相似性較低，分別為82%和81%(圖8)，同源分析結果表明，該蛋白與其他物種的質膜ATPase4相似。

2.4 ATPase4的組織表達分析

提取幼苗K326的根、葉、花成熟期的總RNA，進行去除DNA基因組，然后反轉錄成cDNA，以cDNA為模板進行熒光定量PCR擴增，通過對ATPase4在各個組織的表達量分析(圖9)的結果表明，ATPase4基因在根中表達量最高，葉和花中表達量較低。根中表達量約為葉的8.9倍，這說明ATPase4基因主要在煙草K326植株的根中表達。

2.5 ATPase4在逆境脅迫處理下的表達分析

分別選取經KCl(10 mmol·L-1)、5% PEG-6000、NaCl(200 mmol·L-1)以及4 ℃處理后的煙草K326幼苗，對其ATPase4基因的相對表達量進行分析。結果表明，在低鉀和鹽處理條件下，ATPase4相對表達量分別在6和12 h達到最大值，分別為對照(0 h)的1.73和5.09倍。ATPase4相對表達量在冷處理下受到抑制，是對照表達量(0 h)4 ℃處理24 h的1.99倍。這些結果表明ATPase4能夠被逆境脅迫相關的信號分子調控，其表達量如圖10所示。

圖7 ATPase4蛋白多重序列比對Fig.7 Multiple sequence alignment of ATPase4

圖8 ATPase4蛋白系統進化樹Fig.8 Phylogenetic tree of ATPase4

不同數據間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。The bars without the same lowercase letters showed the significant difference (P<0.05).圖9 不同組織中ATPase4基因的相對表達量分析Fig.9 Relative expression analysis of ATPase4 in different tissues

同一處理不同時間點的數據間沒有相同字母表示差異顯著(P<0.05)。Under the same treatment at different time， the bars without the same lowercase letters showed significance at the level of 0.05.圖10 ATPase4在逆境脅迫下的表達分析Fig.10 Relative expression analysis of ATPase4 under abiotic stress

3 討論

本實驗采用同源克隆的方法，從普通煙草K326中克隆的一個質膜ATPase家族成員ATPase4基因。生物信息學分析表示，ATPase4基因編碼的蛋白具有多個絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化修飾位點，可能與其調節的較多功能相適應。質膜ATPase分布在質膜上，是以兩個催化亞基的形式存在的，是由一個多基因家族編碼的酶類，使這些家族不同的成員具有組織和器官的特異性[12]。質膜ATPase在進化上可以大致分為5個亞家族，而煙草ATPase基因表達模式分析證明為第Ⅱ家族，這種表達模式幾乎在任何組織中都有表達[11，13]。熒光定量PCR結果表明，ATPase4基因在根、葉、花中都有表達，因此推測該基因可能參與了煙草生長的一系列生理反應。劉健健等[14]研究表明，質膜ATPase家族基因在番茄所有組織中都有表達，但在果實中表達較少。ATPase4基因在根中表達量最高，而在葉和花中表達量較低，與番茄質膜ATPase4基因在根中表達量最高相一致[15]。為保證植株正常生長，需從根部吸收更多水分和離子，通過細胞液中積累無機離子或合成有機溶質等方式進行滲透調節以減輕或避免傷害[16]，推測ATPase4基因在煙草和番茄中可能與根中離子運輸有關。

在轉錄水平上，質膜ATPase參與了植物生長發育過程中多種脅迫反應[17]。質膜ATPase在植物生長、發育和對外環境的適應過程中的重要作用已有相關報道，其中，在鹽脅迫過程中質膜ATPase的應答功能研究較多[11-15]。qRT-PCR分析結果表明，煙草ATPase4在低鉀處理6 h時達到最大值，之后又下降，因此推測ATPase4基因可能是在低鉀脅迫早期的響應基因，能快速響應低鉀脅迫，在后期隨著時間的延長其表達受到了抑制，可能是因為植株適應了脅迫。在PEG-6000處理下，ATPase4基因表達水平在0～24 h內逐漸增加。Li等[18]用6% PEG處理大豆種子，質膜ATPase活性隨著處理時間而增強，在12 h活性達到最大，此后到72 h間活性稍許下降，但仍大于對照。Yang等[19]用6% PEG處理大豆種子，與Li等[18]得出結論一致。說明ATPase4基因與干旱脅迫相關，因此推測在PEG處理后基因表達量上升使質膜ATPase活性增強。

經鹽處理，ATPase4基因表達量明顯提高，表達量12 h達到最大，與劉尼歌等[20]得出鹽能誘導煙草質膜ATPase基因表達的結論相一致。Ballesteros等[21]分別用75和150 mmol·L-1NaCl處理向日葵3 d后，提取根的質膜微囊，測定質膜ATPase的活性，結果表明，NaCl處理的向日葵根部質膜ATPase的活性顯著提高。鹽脅迫條件下，抗鹽品種可能累積較多的mRNA，參與作物的相關逆境脅迫，進而導致植物的代謝水平發生相應的改變[22-24]。

冷處理ATPase4基因表達量在早期(3 h)沒有明顯變化，在6 h時約為對照的0.49倍，說明后期冷處理抑制了ATPase4基因表達。簡令成等[24]研究表明，在5 ℃低溫處理番茄幼苗，12 h后幼苗子葉質膜ATPase活性顯著降低。植物在適應低溫時，膜脂從液態變為半結晶態，因而影響膜的流動性，使得基因表達受到抑制，進而導致相關ATP酶活性降低。

本實驗結果表明，ATPase4基因在低鉀、干旱、鹽脅迫和冷脅迫下發揮重要作用，但其編碼的蛋白的具體功能，尚待進一步研究。后續研究將進一步獲得轉基因煙草以及測定轉基因植株的相關生理指標，進一步闡明該基因在逆境脅迫中的作用。