B型肉毒素干預choke Ⅱ區對大鼠跨區皮瓣的影響

李浙峰 周光偉 王 峰 李 悅 徐 東 戴箴言

臨床上組織瓣移植手術是解決組織缺損和創面長期不愈的有效方法。穿支皮瓣以符合“受區修復重建好，供區破壞損失小”的優點，廣泛應用于臨床，成為組織缺損修復技術的研究熱點[1, 2]。穿支皮瓣僅以管徑細小的皮膚穿動脈為蒂取瓣，故其供皮面積往往偏少，以三血管體為例，壞死常發生在潛在區，極大限制了穿支皮瓣的跨區切取。肉毒毒素(BTX)的應用在近十年發展迅速，以往研究發現BTX可以通過擴張血管改善皮瓣組織灌注，同時對皮瓣血管新生也起著重要的作用。而目前皮瓣領域研究較多的集中在A型肉毒毒素(BTX A)，對B型肉毒毒素(BTX B)近來也開始有所研究，BTX B與BTX A結構和功能相似，目前還沒有相關報道將BTX B局部應用于choke Ⅱ區域以逆轉跨區穿支皮瓣潛在區壞死的研究。本研究擬觀察BTX B術中干預choke Ⅱ區對大鼠背部跨區穿支皮瓣成活的影響，并討論其作用機制。

材料與方法

1.實驗試劑及動物:B型肉毒毒素：(愛爾蘭Elan制藥公司)，紅色氧化鉛Pb3O4(中國上海試劑總廠)，RT-PCR試劑盒(美國Thermo公司)，SYBR Green I Master(美國Roche公司)，TRIzol(美國Invitrogen公司)。雄性健康SD大鼠50只，由溫州醫科大學實驗動物中心提供，SPF級，實驗動物許可證號：SCXK(浙)2005-0019，體重200～300g。

2.實驗分組及模型制備：大鼠隨機分為實驗組(B型肉毒毒素組)和對照組(生理鹽水組)，各25只。皮瓣掀起術后即刻，實驗組在皮瓣choke Ⅱ區均勻皮下間隔0.2mm注射100U，總計1500U(約0.3ml)BTX B，對照組采用相同劑量生理鹽水均勻注射choke Ⅱ區[3]。所有動物用戊巴比妥鈉麻醉(30mg/kg，腹腔注射)，采用Yang等[4]大鼠皮瓣制作方法，在背部以后正中線為內側緣，髂后上棘連線為下界，肩胛下角為上界，設計保留一側髂腰深動脈穿支為蒂的背部三血管體穿支皮瓣，面積約為9cm×3cm皮瓣。切開皮瓣四周皮膚后，在深筋膜層面完全游離皮瓣，在皮瓣掀起后即刻，按上述方法注射BTX B或生理鹽水，然后用4-0慕斯線，原位縫合(圖1)。手術后1～3天，8萬單位青霉素G腹腔注射，1次/天。

圖1 切取以髂腰動脈穿支為蒂的跨區三血管體穿支皮瓣，將皮瓣原位縫合，choke Ⅰ及choke Ⅱ區中央區用苦味酸標記A.切取皮瓣;DCI.髂腰動脈穿支;IC.肋間后動脈穿支;TD.胸背動脈穿支;B.將皮瓣原位縫合

3.觀察指標:(1)皮瓣觀察及記錄皮瓣成活:術后第7天麻醉下數碼相機拍攝高質量圖片，導入計算機圖像軟件(M2 Image Analysis System)計算皮瓣成活面積百分比，即皮瓣成活率。皮瓣壞死標準包括組織回縮、彈性差，質地堅硬，切割組織不出血。(2)明膠-氧化鉛血管造影:分別于術后第7天取對照組、實驗組各5只大鼠，采用明膠-氧化鉛灌注法對大鼠行全身灌注血管造影。麻醉下將22-規格容量留置針置入大鼠頸總動脈，放血排盡大鼠體內血液，注入1%肝素1.5ml，用20ml注射器將配置好的20ml明膠-氧化鉛混合物(含明膠1g、四氧化三鉛20g、蒸餾水20ml)注入頸總動脈，直至大鼠鞏膜及四肢末端顯現出點狀、斑片狀紅色。然后將灌注后標本置于4℃冰箱冷藏24h后，切取大鼠背部皮瓣，平鋪行X線攝影。(3)實時熒光定量RT-PCR測VEGF、HIF-1α表達：術后第7天將大鼠處死，實驗組、對照組各10只，取跨區穿支皮瓣choke Ⅱ區中央區域皮瓣組織。將切取的組織塊(約100mg)置于1ml Trizol液中，采用生物勻漿機(Master Prep，MAK 6075-047 Hichuang bioer，中國)勻漿，按照Trizol法提取組織中總RNA，采用分光光度計檢測RNA純度及濃度(A260/A280>1.8)。根據濃度取1μg總RNA反轉錄成cDNA，再進行PCR擴增。VEGF上游引物5′- CTGCTGTACCTCCACCATGC -3′，下游引物5′- CTGGCTTTGGTGAGGTTTGA -3′；HIF-1α上游引物5′- GATGGCTCCCTTTTTCAAGC- 3′，下游引物5′-TTTCTGCTGCCTTGTATGGG- 3′；β-actin上游引物5′- AGTTGAGGGGGACTTTCCCAGG -3′，下游引物5′- CCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT -3′(由美國Invitrogen公司合成)。在無菌去酶的 Eppendorf 管中將配置好的 Real-time PCR反應液(反應總體積為 20μl)離心數秒，混勻后迅速置入Roche LightCycier?480 實時熒光定量 PCR儀中，采用兩步法qRT-PCR擴增程序：Stage One預變性 95℃ 5min，Stage two95 ℃，10s，60℃ 10s，72℃ 10s，共45個循環，獲得各樣本待測基因的Ct值，采用ΔΔCt法進行試驗數據處理,其結果代表目的基因表達的相對定量，以對照組作為矯正樣本。(4)組織學檢測:術后第7天取實驗組、對照組各10只，切取跨區穿支皮瓣蒂部及choke Ⅱ區中央區域組織，面積約3cm×0.5cm，以10%甲醛溶液固定組織塊，常規脫水包埋，制成3～4μm厚的切片并行HE染色。術后7天在10×10倍鏡下在蒂部區域測量穿支動脈管徑，管徑=(最大橫徑+最大縱徑)/2。于10×10倍視野下，在choke Ⅱ區中央區域找到微血管密集區，然后于20×10倍光鏡下隨意選取5個視野，計數血管數并取平均值，計算出單位面積微血管數(個/平方毫米)作為評價微血管密度(MVD)的指標。

結 果

1.皮瓣大體觀察及成活率:術后第7天，兩組皮瓣遠端壞死部分均趨于融合，手感變硬，呈干性壞死，界線清晰(圖2)。實驗組和對照組背部皮瓣壞死率分別為90.0%±2.9%和75.0%±3.2%，實驗組皮瓣的成活面積顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。

圖2 術后7天大鼠背部三血管體穿支皮瓣的成活情況A.對照組;B.實驗組

2.明膠-氧化鉛照影:實驗組各血管體區血管結構較為完整，choke Ⅰ及Ⅱ區血管結構清晰。在choke Ⅰ及Ⅱ區出現了大量的真性吻合(choke血管擴張)。遠端壞死區域顯示胸背動脈穿支入皮點以遠僅部分紊亂或消失。對照組明膠-氧化鉛造影示choke Ⅰ區、choke Ⅱ區的choke血管擴張不顯著，第三血管體區血管結構較為紊亂，遠端壞死區域顯示胸背動脈穿支入皮點附近及遠端血管結構紊亂或消失(圖3)。

圖3 大鼠背部三血管體皮瓣模型動脈造影A和B分別為實驗組及對照組術后7天明膠-氧化鉛動脈造影圖。在choke區，實驗組A較對照組B出現了大量的真性吻合(真性吻合為管徑變粗的choke血管)

3.實時熒光定量RT-PCR測VEGF、HIF-1α mRNA表達：術后第7天，實驗組VEGF、HIF-1α mRNA表達均較對照組有所提高。實驗組choke Ⅱ區VEGF、HIF-1α mRNA表達量分別為2.10±0.56、1.98±0.33，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01，圖4)。

圖4 實時熒光定量RT-PCR測choke Ⅱ區的VEGF、HIF-1α mRNA表達實驗組與對照組比較，差異有統計學意義；與對照組比較，*P<0.01

4.組織學檢測:兩組皮瓣蒂部區的組織形態無明顯差異，實驗組穿支動脈的管徑較對照組明顯增大(圖5)。實驗組穿支動脈管徑及對照組穿支動脈管徑分別為158.00±20.12μm、83.33±12.79μm，差異有統計學意義(P<0.01)。在choke Ⅱ區組織中，實驗組及對照組微血管計數增多，分別為(43.36±9.11)個/平方毫米和(34.16±7.12)個/平方毫米，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖5 對照組與實驗組皮瓣蒂部穿支動脈區組織HE染色(×100)A.對照組穿支動脈(a)及靜脈(V)； B.實驗組穿支動脈(a)及靜脈(V)

討 論

以往研究發現跨區穿支皮瓣壞死常常發生在潛在區，從而在根本上大大限制了跨區穿支皮瓣的擴大切取[5～8]。與此相反，動力學區往往都能成活，可能與 choke 區管徑小、血流阻力大有關，當源動脈供應血流跨越動力學區至choke Ⅱ區時，減少的血流量已無法滿足潛在區組織代謝及成活[9]。另一方面，血管新生歷來被認為與皮瓣成活密切相關。國內外大量的研究顯示血管新生參與了皮瓣的成活[10]。因此采取某種行之有效的方法使這3個不同供區之間的吻合血管開放、擴張乃至血管新生，進而通過新建的血液循環體系將3個不同的小供區變成一個大供區，可以提高跨區穿支皮瓣的成活率。

BTX由肉毒桿菌產生，屬于多肽，從A至G，有7種血清型。BTX雖然有7種不同類型，但結構和功能相似。近來，越來越多的研究證明，BTX對血管有著不同程度的影響。首先BTX可以在神經肌肉連接處抑制乙酰膽堿的釋放，通過化學去神經化作用于受交感神經系統支配的血管平滑肌細胞[11]。其次，BTX作用于Rho激酶，通過影響血管平滑肌細胞對鈣離子的敏感度及NO系統直接抑制平滑肌細胞的收縮，從而使得血管擴張[12, 13]。另外，研究發現BTX A可以通過減弱自主神經釋放去甲腎上腺素來抑制交感神經收縮血管[14]。因此，BTX可以通過擴張血管改善皮瓣組織灌注、氧攜帶量、代謝，最終提高皮瓣的成活率。Park等[3]報道吻合大鼠股動靜脈術前3天將BTX B局部注射于股動脈周圍，隨后分別測量吻合前后股動靜脈管徑以及血流速度，發現經BTX B預處理后誘導了血管擴張，減少了血管阻力，因此血流速度得到明顯增加，從而也有效地預防了血栓的形成。筆者的實驗中，實驗組中皮瓣choke Ⅰ及choke Ⅱ區choke血管真性吻合較明顯多于對照組，從而改善了皮瓣遠端的灌注。Arnold等[15]報道，將BTX A局部浸潤1支三血管體皮瓣蒂部血管，結果并未明顯提高皮瓣成活率及改善缺血區域，其分析原因可能是BTX A保護作用可能在遠期，而本實驗提示BTX B干預后皮瓣成活率明顯增加，可能與BTX B在早期起效后通過擴張choke 血管改善了皮瓣血循環。

BTX對皮瓣血管新生也起著重要的作用。VEGF在改善皮瓣成活方面，是目前研究最為廣泛且最為成功的生物因子[16]。它是缺氧組織在病理或者生理條件下釋放的，是調節血管新生的關鍵因子[17]。Patel等[18]證實經BTX A局部注射預處理后的大鼠腹直肌(TRAM)皮瓣中，蒂部血管管徑、VEGF、CD31均有明顯提高。Kim等[19]同樣也報道，經BTX A干預后的大鼠背部隨意皮瓣組織中，血管管徑增加,微血管數量明顯增多，一些被認為與血管擴張及血管內皮細胞增生有關的生物分子，如VEGF、CD31及iNOS，含量也明顯提高。隨后，Park等[20]又報道了經BTX A術前預處理后的大鼠TRAM皮瓣組織中，CD34、VEGF、HIF-1α的含量均有明顯提高，認為BTX A可能通過HIF-1α/VEGF通路改善了皮瓣血管新生，從而促進了TRAM皮瓣的成活率。VEGF是處于HIF-1α下游序列的靶基因，而HIF-1α是一種可以調節體內氧平衡和血管新生的轉錄因子，VEGF的上調作用可能來自HIF-1α[21]。筆者發現在實驗組choke Ⅱ區，HIF-1α、VEGF的表達明顯高于對照組，其可能原因是通過對HIF-1α的積累增加了 VEGF的表達，從而促進了choke Ⅱ區血管新生，進而促進了跨區穿支皮瓣的成活率，但其具體作用機制還有待進一步研究。

本實驗同時發現實驗組蒂部穿支血管第管徑較對照組明顯擴張，其原因可能正是由于通過choke 血管的擴張及choke Ⅱ的血管新生帶動了整個皮瓣的血流量的增加，從而反饋性的擴張了蒂部穿支動脈的管徑，但需進一步對血流量的改變進行研究。

綜上所述，結合本實驗數據結果及皮瓣成活情況，應用B型肉毒毒素術中干預choke Ⅱ區能有效地刺激大鼠背部跨區穿支皮瓣血管新生，擴張choke血管增加皮瓣遠端的血流供應量，同時擴張了蒂部穿支動脈，從而降低了跨區穿支皮瓣潛在區的壞死率。