非瓣膜病心房顫動患者血漿miR-486和miR-150的表達水平及臨床意義

劉文華 陶潞淵 徐恩國

心房顫動(以下簡稱房顫)是指心房以無規則、快序、紊亂的顫動波取代了規則有序的電活動，導致心房失去了有效的收縮功能，是臨床上最嚴重的心房電活動紊亂[1，2]。非瓣膜性房顫是房顫的重點，其所占比例明顯高于瓣膜性房顫[3]。非瓣膜性房顫易導致心房血液淤滯，易形成血栓，血栓并發急性心肌梗死是非瓣膜性房顫最大的危害。我國每年約有 170 萬人因非瓣膜性房顫并發急性心肌梗死而入院，其30 天再發心肌梗死率為8%～10%，心力衰竭發生率為15%～30%，病死率為6%～8%[4,5]。微小RNA(microRNA，miRNA)能調控轉錄水平后的基因翻譯，其機制為結合信使RNA的3′端非翻譯區進行調控，此外胚胎的發育、細胞增殖與分化均與miRNA關系密切[6，7]。miR-150低表達還可致使血管內皮嚴重損傷，激活凝血反應鏈，導致纖維蛋白及免疫球蛋白也應激增高，形成高凝狀態和纖溶亢進，終致血液黏滯性及凝固性增加而處于高凝狀態或血栓前狀態，進一步誘發心房顫動及心力衰竭的產生[8，9]。在急性心肌炎、類風濕關節炎、骨關節炎中，miR-486表達降低，提示miR-486在此類疾病中發揮重要調控作用[10]。本研究擬探討非瓣膜病房顫患者患者血清miR-486和miR-150水平其臨床診斷價值，并與傳統的非瓣膜病房顫評價指標左心房內徑(left atrial diameter，LAD)及左心室射血分數(left ventricular ejection fraction ，LVEF)為非瓣膜病房顫的早期診斷及治療提供理論及實踐基礎。

資料與方法

1.一般資料：選取2015年10月～2017年11月在筆者醫院心血管內科確診的非瓣膜病房顫患者80例為病例組，經臨床表現、實驗室檢查(血常規、血生化)及心電圖、冠脈造影診斷確診, 符合2013 年《美國心房顫動管理治療指南》[11]診斷標準(心房顫動是一種室上性快速心律失常，出現不協調的心房激動并導致心房收縮無效), 且心電圖特診包括規則有序的 P 波消失R-R 間期不規則，代以不規則的心房顫動波。選擇同時期于筆者醫院門診健康體檢者76例作為對照組，對照組均無既往肺栓塞病史、惡性腫瘤、6周內手術史、下肢外傷史、心功能不全、腦血管意外、長期臥床史。對照組76例，其中，男性36例，女性40例，患者年齡46～70歲，平均年齡58.7±12.7歲。均簽署知情同意書。納入標準：患者 LDL-C水平超過 100mg/dl；既往有短暫腦缺血發作或缺血性卒中或體循環動脈栓塞史；初中以上文化水平；控制良好的輕、中度高血壓(血壓≤160/100mmHg)。本研究經筆者醫院醫學倫理委員會審批；所有患者(或患者直系親屬)均簽署知情同意書。排除標準：可逆性因素所致非瓣膜病房；孕婦或近3個月有手術、創傷史；冠心病以外的其他心臟病、心功能不全，合并未控制的嚴重高血壓、瓣膜性心臟病以及急診冠狀動脈介入治療者。終止、退出標準：患者依從性差；出現嚴重不良事件及其他原因致使繼續試驗困難。

2.主要儀器及試劑：貝克曼AU-480全自動生化分析儀(美國庫爾特公司)、S2000心臟彩色超聲多普勒分析儀(德國西門子公司)、Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，反轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒(碧云天生物技術公司產品)、miR-486、miR-150基因的表達測定采用UltraSYBR One Step RNA PCR Kit(寶生物工程大連有限公司)、實時熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)、NanoDrop2000c 型蛋白核酸檢測儀(美國Thermo公司)、恒溫培養箱grp-9080(美國通用公司)、超凈工作臺(上海恒躍醫療器械有限公司)。 TG、HDL-C、LDL-C試劑盒為AU-480全自動生化分析儀原廠自帶試劑。

3.方法：S2000心臟彩色超聲多普勒分析儀測定病例組及對照組患者LAD、LVEF(%)。同時病例組及對照組患者清晨空腹及肱靜脈抽血；取靜脈血10ml置于無菌管中，室溫靜置30min，3000r/min離心,10min，分離血清，貝克曼AU-480全自動生化分析儀測定甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol ，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol ，LDL-C)，剩余血清用于測定miR-486、miR-150基因的表達，參照GenBank 數據獲取 2 個基因多態性位點的序列，設計待測基因位點的PCR 擴增引物和單堿基延伸引物，按20μl 模板和 50μl 反應液構成 PCR 反應體系， 擴增程序:95℃ 5min; 93℃10s，61℃ 30s，重復 40個循環，61℃ 時采集熒光(表1)，RT-PCR反應體系為：2×超級賽博一步法 RT-qPCR 緩沖液5μl，正向引物(10μmol/L) 0.4μl，反向引物(10μmol/L)0.4μl，超級酶混合物0.2μl，RNA模板0.6μl，去核糖核酸酶水3.4μl。實時熒光定量 PCR 儀檢測其表達量。

表1 miR-486、miR-150引物序列

結 果

1.兩組一般情況比較：由表2可見，兩組在性別、年齡、BMI、吸煙、冠心病、糖尿病、飲酒、高血壓、高脂血癥等一般資料比較,差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 兩組一般情況比較

2.兩組miR-486、miR-150指標比較：由表3可見，病例組miR-486、miR-150表達水平低于對照組，差異有統計學意義(t=17.54、19.02，P<0.05)。

表3 兩組miR-486、miR-150指標比較

與對照組比較，*P<0.05

3.兩組血脂指標比較：由表4可見，病例組HDL-C水平低于對照組，TG、LDL-C水平高于對照組，差異有統計學意義(t=17.43、18.13、20.16，P<0.05)。

表4 兩組血脂指標比較

與對照組比較，*P<0.05

4.兩組LAD、 LVEF常規評價指標比較：由表5可見，病例組LAD水平高于對照組，LVEF水平低于對照組，差異有統計學意義(t=17.43、20.42，P<0.05)。

表5 兩組LAD、 LVEF常規評價指標比較

與對照組比較，*P<0.05

5.miR-486、miR-150與各指標相關性分析：由表6可見，miR-486、miR-150與TG、HDL-C、LDL-C、LAD呈負相關，與LVEF呈正相關，差異有統計學意義(R=-0.541、-0.567、-0.569、-0.624、-0.498、-0.501、-0.566、-0.594，0.644、0.587，P<0.05)。

6.各指標診斷非瓣膜病心房顫動的價值分析：由表7可見，診斷非瓣膜病心房顫動時，miR-486、miR-150的AUC與LVEF相近，差異無統計學意義(Z=1.65、1.52，P>0.05), miR-486、miR-150的AUC均高于LAD 、TG、HDL-C、LDL-C，差異有統計學意義(Z=14.67、13.57、15.32、11.78、13.41、15.78、12.14、13.98，P<0.05)。

表6 miR-486、miR-150與各指標相關性分析

表7 各指標診斷非瓣膜病心房顫動的價值分析

討 論

miRNA是在線蟲體內發現的一種具有高度進化保守性的非編碼小 RNA。作為較早發現的一種 miRNA，其在調控細胞的基因表達方面有極其重要的作用，同時在腫瘤的發生、發展中也扮演者重要的角色[12]。經典的miRNA作用途徑是通過堿基互補配對與靶信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)的3’端非編碼區特異性結合抑制miRNA的翻譯。

研究發現miR-486蛋白可介導細胞的定向轉移和趨化性，并激活淋巴細胞、內皮細胞、中性粒細胞、上皮細胞上相應的趨化因子受體[13]。miR-486在調節人體細胞的復制、遺傳物質脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)損傷修復、以及炎性細胞的產生、轉移等方面有重要作用。遺傳基因學發現miR-486過表達是引發大部分自身性炎性反應的主要原因，高度表達miR-150蛋白的淋巴細胞株增殖能力明顯高于野生株[14]。miR-486 mRNA除了具有經典的miRNA作用方式，還存在非經典的miRNA作用方式，即與靶mRNA的結合方式：miR-486 mRNA與靶mRNA的5′端結合可發揮轉錄后抑制的作用；一項研究表明，下調miR-486可能導致鈣調素依賴性蛋白激酶對蘭尼堿受體2在 S2814 位點的過度磷酸化，其機制與miR-486抑制蛋白磷酸酶2(protein phosphatase 2,PP2A )調節亞單位 B56α有關，進而促使肌質網內的鈣離子大量釋放，心肌細胞內鈣循環穩態失衡，心肌興奮-收縮耦聯增強，蘭尼堿受體2鈣離子通道的活性加強，導致房顫發生[15]。Forman等發現let-7a可作用于Dicer酶mRNA的編碼區，抑制Dicer酶的表達。白細胞介素-8、血管內皮生長因子由可能由miR-486調控，低表達miR-486蛋白的淋巴細胞可分泌更多的白細胞介素-8、血管內皮生長因子，而白細胞介素-8、血管內皮生長因子在供應炎癥的形成過程中發揮重要作用。此外miR-486還可致使血管內皮嚴重損傷，膠原組織暴露，組織因子釋放，刺激血小板附著和聚集，從而激活凝血反應鏈，導致纖維蛋白及免疫球蛋白也應激增高，形成高凝狀態和纖溶亢進，終致血液黏滯性及凝固性增加而處于高凝狀態或血栓前狀態，進一步誘發房顫[16]。

miR-150可通過阻斷蛋白激酶 B信號通路抑制心血管內皮細胞增殖和集落形成，在急性心肌炎、類風濕關節炎、骨關節炎中，miR-150表達降低，提示miR-150在此類疾病中發揮重要調控作用[17]。miR-150通過調控鉀離子通道及鈣離子水平來影響心肌細胞的電生理活動。miR-150靶向作用于 PP2A 的催化和調節亞基并抑制其表達，引起舒張期 Ca2+峰及后除極發生改變，導致 Ca2+/Ca MKⅡ依賴性蘭尼堿受體2在S2814 位點和S2030 位點的磷酸化增加，容易誘發室性心律失常[18]。miR-150通過各種多功能蛋白、生長因子信號、受體分子等參與細胞內周期進程的調控，并對細胞 DNA 的復制起始和增殖起到十分重要的作用。研究表明miR-150與胚胎的發育有關，能直接下調Nodal蛋白家族中的squint蛋白，還能調控Nodal蛋白的抑制劑letfy[19]。

本研究結果顯示，病例組miR-486、miR-150表達水平低于對照組，差異有統計學意義；病例組HDL-C水平低于對照組，TG、LDL-C水平高于對照組，差異有統計學意義；病例組LAD水平高于對照組，LVEF水平低于對照組，差異有統計學意義；miR-486、miR-150與TG、HDL-C、LDL-C、LAD負相關關系明顯，與LVEF呈正相關，差異有統計學意義，說明非瓣膜病房顫患者血清中miR-486、miR-150水平降低，且miR-486、miR-150與TG、HDL-C、LDL-C、LAD呈負相關，與LVEF呈正相關，診斷非瓣膜病房顫時，miR-486、miR-150的AUC與LVEF相近，差異無統計學意義,miR-486、miR-150的AUC均高于LAD 、TG、HDL-C、LDL-C，差異有統計學意義，則說明miR-486、miR-150診斷非瓣膜病房顫的AUC與LVEF相近，適合在臨床上推廣應用。

綜上所述，非瓣膜病房顫患者血清中miR-486、miR-150水平降低，且miR-486、miR-150與TG、HDL-C、LDL-C、LAD呈負相關，與LVEF呈正相關，miR-486、miR-150診斷非瓣膜病房顫的AUC與LVEF相近，適合在臨床上推廣應用。