拱棚覆網對喀什地區復播甜瓜病毒病的防治效果

毛建才，王豪杰，李俊華，翟文強

(新疆農業科學院哈密瓜研究中心，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】喀什地區光熱資源豐富，平原地區平均無霜期215 d，小麥收割后適合復播甜瓜生產。傳統上復播甜瓜在6月底到7月上旬播種，9月底到10月上旬采收，果實不僅品質好且非常耐貯。由于復播甜瓜的銷售價格高于正播甜瓜(7月下旬到8月上旬上市)2～4倍。但近年由于病毒病危害，常規方法已無法種植復播甜瓜，研究通過改進栽培模式，研究喀什地區復播甜瓜病毒病的防疫，對甜瓜抗病育種有實際意義。【前人研究進展】關于新疆甜瓜病毒病的報道僅限于正播甜瓜，對于復播甜瓜病毒病的種類及優勢病毒尚沒有報道。到目前為止，引起正播甜瓜病毒病的主要是黃瓜花葉病毒(CMV)、西瓜花葉病毒(WMV)和小西葫蘆花葉病毒(ZYMV)[1-3]，引起復播甜瓜病毒病的種類還有待確定。【本研究切入點】病毒病是影響復播甜瓜最重要的病害，通過覆蓋防蟲網防治復播甜瓜病毒病的方法未見報道，研究該種栽培方式下的甜瓜產量、品質、商品率等，評價其生產應用的可行性及應用前景。通過小拱棚覆蓋防蟲網能夠隔絕傳毒媒介昆蟲的傳毒，降低復播甜瓜病毒病的發生率。但此種方法對復播甜瓜病毒病的防治效果以及對甜瓜坐果、產量和品質的影響需要明確。研究揭去防蟲網后，既能達到防治病毒病的最大化，又影響甜瓜正常授粉，并達到坐果率及果品質量最優化。【擬解決的關鍵問題】研究不同時期揭去防蟲網甜瓜的產量、品質和商品率，分析最佳揭網時間，確定該種栽培模式的可行性及應用前景和引起喀什地區復播甜瓜病毒病種類，對選擇的材料進行抗病性篩選，為生產和抗病育種研究打基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

毒源按各病毒病發病時期采自新疆喀什各個地區，之后迅速置于液氮中冷凍保存備用。RNA提取試劑盒，DNA純化、回收試劑盒購自天根生物公司，HIFIScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒購自康為世紀公司，其他常規試劑均購自北京全式金公司，大腸桿菌DH5α由本試驗室保存，氨芐霉素(Amp)的使用濃度為100 μg/mL。表1

防蟲網罩(60目)購自喀什，復播甜瓜試驗品種(系)“金秀”、溫室抗病性鑒定材料均由新疆農業科學院哈密瓜研究中心提供，田間試驗在新疆農業科學院哈密瓜研究中心疏勒研究示范基地進行。

表 1 供試材料及來源Table 1 Information of the test materials

1.2 方 法

1.2.1 拱棚覆網栽培模式

甜瓜簡約化栽模式參照王豪杰等[4]的進行，播種后立即搭建拱棚覆蓋防蟲網。

1.2.2 撤防蟲網最佳時間確定1.2.2.1 病情指數調查

采用隨機區組試驗，將試驗地分為4個小區，命名為1、2、3、4號小區，每個小區設置三個重復，6月25號播種，之后覆蓋防蟲網，以不覆蓋防蟲網的小區作為對照。分別于7月20日，7月25日、8月1日和8月5日撤去第1、2、3、4號小區的防蟲網。撤去防蟲網一周后逐日觀察癥狀，30 d后記錄癥狀等級，分級標準參照陳潔云等[6]等的方法進行，統計每個重復的病情指數。

1.2.2.2 果品質量參數統計

中心折光糖度測定用電子測糖儀測量，每個小區隨機選取5個單瓜測量；產量的統計方式是從每個小區隨機選取20個單瓜稱重，取平均值折合成單位面積產量。平均單株結果數、商品率的計算方式參照王豪杰等[4]的方法進行。

1.2.3 甜瓜病毒總RNA的提取

將樣品置于液氮中迅速研磨成粉狀，裝100 mg左右的組織加入1 mL TRizol，200 μL氯仿，在室溫中放置5 min，使核酸和蛋白質完全分離，之后置于4℃離心機中，12 000 r/min離心10 min。吸取上清，加入600 μL氯仿、200 μL無水乙醇，12 000 r/min離心10 min。吸取上清，加入等量的異丙醇，顛倒混勻，在冰上放置10 min，繼續離心10 min，棄去上清液，沉淀用1mL的乙醇(Φ=75%)洗滌2次，置于室溫中干燥，用適量的DEPC水溶解，檢測純度和濃度后，分裝保存于-80℃冰箱中備用。

1.2.4 病毒 cDNA第一鏈合成

病毒cDNA第一鏈的合成采用康為實際公司的反轉錄試劑盒進行。向DEPC水處理過的PCR管中1 μg總RNA，1 μL gDNA Eraser Buffer，0.5 μL gDNA Eraser，用無核酸酶的純水補充至10 μL，混合均勻，短暫離心后在42℃水浴鍋中反應2 min。反應結束后，短暫離心置于冰上冷卻。之后再加入1 μL HiFiScript，1 μL Primer Mix，4 μL反應Buffer，4 μL無核酸酶的高純水，混合均勻，短暫離心后置于42℃水浴鍋中反應15 min，85℃反應5 min終止反應。將cDNA分裝后置于-20℃保存備用。

1.2.5 引物設計

PCR引物參照李繼洋[1]等的設計，由北京六合華大基因公司合成。表2

表2 甜瓜3種病毒PCR反應引物Table 2 Primer information for PCR reaction of three virus in melon

1.2.6 病毒RT-PCR檢測

隨機選取15個供試樣品，提取總RNA并合成cDNA第一鏈，用于RT-PCR檢測。反應體系(25 μL)包括：2.5 μL 10×Buffer(含MgCl2)，2 μL dNTPs(10 mmol/L)，上下游引物(10 μmol/L)各1、0.5 μLTaqDNA聚合酶，1 μL模板cDNA，ddH2O補足至25 μL。PCR反應條件為：30 × (94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 1.5 min)，最后，72℃ 10 min。產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并記錄結果。

1.2.7 病毒PCR產物的純化與連接

將凝膠中與GenBank中比對的WMV、CMV、ZYMV CP蛋白基因片段預測大小相近的擴增產物條帶進行切膠回收。利用瓊脂糖DNA回收試劑盒(DP209-03)進行純化。具體方法參照試劑盒使用說明。將切下的膠塊稱重，加入等倍體積溶膠液，50℃水浴放置，待膠塊完全溶解之后，將所得溶液加入吸附柱中，室溫放置2 min，之后12 000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的廢液；用600 μL漂洗液漂洗2次，棄廢液，12 000 r/min離心2 min，室溫干燥。將吸附柱放到一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫緩沖液，室溫放置2 min，之后置于離心機12 000 r/min離心2 min，得到回收片段。

將回收片段連接到pMD18-T載體上(具體方法參照試劑盒使用說明)，利用熱擊轉化技術轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，37℃暗培養12 h。挑取單菌落于LB(含有Amp)培養基中37℃、200 r/min振蕩培養。進行菌液PCR 擴增，檢測得到陽性克隆并送往公司測序(北京六合華大基因有限公司)。

1.2.8 抗病性鑒定

室內進行品種抗病性測定。選取本單位的10個材料，經過表面消毒后在營養缽中種植，每個材料設置3個重復，每個重復接種30 株幼苗。所用的土壤事先高溫高壓滅菌處理。待幼苗長出兩片真葉時選擇生長一致的健康植株，采用汁液摩擦接種法進行病毒接種[5]。將接種的幼苗置于防蟲溫室中，溫度控制在21 ～ 28℃。接種5 d后逐日觀察癥狀，接種30 d待病情穩定后，統計病情指數，初步評估這幾個品種的抗病性。

根據甜瓜病毒病癥狀特定，參照陳潔云[5]制定以下分級標準：

0，無明顯癥狀；1，葉片輕花葉或輕度卷葉；2，重花葉或植株輕度矮化；3，嚴重皰斑花葉伴隨畸形，植株無明顯矮化；4，葉片明顯縮小伴重度畸形花葉，植株明顯矮化。

病情指數(DI)=100×∑(病害的級數×該級病害株數/病害的最高級×樣本總數)。

2 結果與分析

2.1 撤防蟲網最佳時間

2.1.1 病情指數

分別于7月20日，7月25日、8月1日和8月5日撤去各處理小區的防蟲網。5 d后逐日觀察癥狀，30 d后統計對照和4個處理小區的病情指數， 結果顯示對照的病情指數是83.64，4個處理小區的病情指數分別是53.82、37.25、24.25和21.07，各個處理與對照之間的差異極顯著，小拱棚覆蓋防蟲網對減輕復播甜瓜病毒病的發生有顯著的效果。圖1

M：對照小區(Mock)；1：7月20日撤去防蟲網；2：7月25日撤去防蟲網；3：8月1日撤去防蟲網；4：8月5日撤去防蟲網

2.1.2 產量

平均單株結果數是構成產量的主要因素，而病毒病是影響復播甜瓜單株結果數和產量的主要原因，不同時期撤去防蟲網后的病情指數有差異，蟲媒雌花授粉率也各不相同，導致單株平均結果數與產量也不同。

在7月20日，7月25日、8月1日和8月5日撤去各處理小區的防蟲網，收獲前統計各小區的平均單株結果數和產量。結果顯示，沒有覆蓋防蟲網的對照小區，平均單株結果數為0.4個，幾乎絕收，其他處理的4個小區平均單株結果數分別為2.3、2.5、3.1和2.2個。在8月1日揭去防蟲網復播甜瓜產量最高。圖2

注：A：平均單株結果數；B產量；M：對照小區(Mock)；1：7月20日撤去防蟲網；2：7月25日撤去防蟲網；3：8月1日撤去防蟲網；4：8月5日撤去防蟲網

2.1.3 品質和商品率

研究表明，對照的平均含糖量為10.9，4個處理小區的平均含糖量依次為15.9、15.7、15.8和15.3，各個處理之間的差異不顯著。覆蓋防蟲網有效的減輕了病毒病的危害，保證了復播甜瓜的品質，滿足商品瓜的含糖量要求。圖2

復播甜瓜肥水管理等方面做的比較精細，在將病毒病控制好的前提下，商品率能達到較高水平。試驗田對照的商品率為8.9%，4個處理小區的商品率分別為70.8%、71.5%、79.3%和76.9%，在8月1日揭去防蟲網，商品率最高。圖3

注：A：中心折光含糖量；B商品率；M：對照小區(Mock)；1：7月20日撤去防蟲網；2：7月25日撤去防蟲網；3：8月1日撤去防蟲網；4：8月5日撤去防蟲網

應用 WMV、ZYMV 和CMV特異性引物分別檢測伽師縣、麥蓋提縣、疏勒縣、疏附這四個地區收集到的畸形、花葉型和黃化型病毒病樣。經過1%的瓊脂糖凝膠電泳后，CMV特異性引物經反應，擴增得到476 bp的特異性條帶(圖4A)；WMV擴增得到1 000 bp的特異性條帶(圖4B)；ZYMV擴增得到1 100 bp的特異性條帶(圖4C)。通過回收、測序，在GENBANK上進行比對，這三個地區所采集到的樣品均能檢測到WMV、ZYMV 和CMV三種病毒，這與夏季正播甜瓜的病原是一致的，且多為復合侵染。圖4

2.2 不同甜瓜品種的抗病性鑒定

在接種一周后逐漸觀察，接種30 d后，發病的植株出現典型的黃化、花葉、植株矮化等癥狀，統計病情指數。抗病性鑒定結果顯示，所有供試品種中，黃皮9818的病情指數最高，是71.39，K-1的病情指數最低，是7.22，達到了耐病的水平。所有的對照處理植株均表現健康。表3

注:A：黃瓜花葉病毒(CMV)鑒定結果；B：西瓜花葉病毒(WMV)鑒定結果；C：小西葫蘆黃花葉病毒(ZYMV)鑒定結果；M：DL-2000 marker；—：陰性對照

表3 不同甜瓜品種抗病性鑒定結果Table 3 Resistance test for various melon cultivars against melon virus

3 討 論

甜瓜生產在喀什地區的農村經濟發展和農民脫貧增收中具有重要的作用，是極有區域優勢的重大特色產業[6]。喀什地區有著獨特的氣候條件和豐富的光熱資源，小麥收割后種植復播甜瓜是一種積極而有效的選擇，對延長甜瓜市場供應期、促進農民脫貧增收有很重要的現實意義。病毒病是影響復播甜瓜生產最主要的病害，嚴重影響產量和品質[6-9]。病毒是分子病原物，目前尚無有效的防治方法和防治藥劑，一旦流行，就會造成較為嚴重的為害[10]，對于復播甜瓜極大可能造成絕收。昆蟲是甜瓜病毒病傳播最有效的媒介，7月是喀什地區蚜蟲、粉虱等媒介昆蟲的主要傳毒期，也是復播甜瓜開花結果的關鍵時期。覆蓋防蟲網能有效隔絕傳毒媒介昆蟲的傳毒，極大程度上降低復播甜瓜病毒病的發生率，但對甜瓜結果會造成影響(蟲媒雌花不能授粉)。該報道對何時撤去防蟲網既能達到防止病毒病的最大化，也不影響甜瓜正常授粉，達到坐果率及果品質量的最優化展開研究。

據文獻報道，在全世界范圍內為害葫蘆科作物的主要病毒為 WMV、CMV、ZYMV、SqMV 和 PRSV[10-20]。 關于新疆地區的甜瓜病毒病也有報道[1]，但限于正播品種，對復播甜瓜的病毒病及優勢病毒尚沒有報道。研究采用RT-PCR對喀什地區幾個復播甜瓜主產區(伽師、麥蓋提、疏勒)的病毒病進行分子生物學鑒定，明確了復播甜瓜病毒病的種類與正播甜瓜的種類一致。

近年來調研發現，目前在南疆主栽的甜瓜品種對病毒病都比較敏感，很難發現對病毒病有良好抗性的品種。因此，研究中除選用了南、北疆一些常見的甜瓜商業品種，還選用幾個新品系進行抗病性鑒定。這些鑒別寄主雖然沒有在大田中大面積栽培，但其很可能存在對病毒有良好抗性的抗病基因[21]。抗病性鑒定結果表明，編號K-1的材料的病情指數僅為7.22，在溫室大棚種植也有較好的抗性，其抗病機理和相關抗性基因的挖掘有待進一步研究。

4 結 論

小拱棚覆蓋防蟲網能有效防治喀什地區復播甜瓜病毒病的傳播與流行，技術可行，前景廣闊。在8月1號前后撤去防蟲網，既能達到病毒防治效果的最大化，也不影響復播甜瓜的授粉和坐果，達到坐果率及果品質量的最優化。喀什地區晚秋復播甜瓜病毒病的種類是WMV、ZYMV 和CMV，且多為復合侵染，這與侵染正播甜瓜病毒病的種類相一致。新疆主栽的甜瓜品種對病毒病都比較敏感，僅K-1在抗病性鑒定中表現良好，在溫室大棚中也有較好的抗性。