三聚磷酸鈉對豬肉肌原纖維蛋白功能特性的影響

葉 浪，李美良，趙 冰，周慧敏，李 素，潘曉倩，張順亮,*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625000；2.中國肉類食品綜合研究中心，肉類加工技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100068）

肌原纖維蛋白（myofibril protein，MP）是一類具有重要生物學(xué)功能特性的鹽溶性蛋白群，是肉制品中最重要的功能性蛋白質(zhì)，主要包括肌球蛋白、肌動蛋白和肌鈣蛋白等[1]。加熱是肉制品加工中的常用工序，能使MP發(fā)生變性，也是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變后重新交聯(lián)形成凝膠的重要條件。Lanier等[2]認為，MP對肉中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)起到?jīng)Q定性作用。在肉制品熱加工中，MP會發(fā)生一系列物理化學(xué)變化，形成穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，賦予肉制品良好的凝膠特性和感官特性[3-4]。三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，STP）是一種常見食品添加劑，具有較高水溶解性。肉制品中添加STP會影響其質(zhì)構(gòu)、色澤等特性，降低產(chǎn)品蒸煮損失，增加產(chǎn)品出品率[5]。STP可以與蛋白質(zhì)中的氨基酸或羥基反應(yīng)，使蛋白質(zhì)引入磷酸基團而改變蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)[6]。在蛋白質(zhì)溶液中添加STP，可有效改善其凝膠強度及保水性。Fukazawa等[7]研究表明，STP能夠弱化肌動球蛋白中肌動蛋白和肌球蛋白之間的作用力，增大肌動球蛋白的解離程度。Eilert等[8]研究發(fā)現(xiàn)，磷酸鹽能提高產(chǎn)品保水性和乳化穩(wěn)定性。

近年來，有關(guān)肉制品的研究主要是通過使用添加物或改變加工工藝條件來改善其品質(zhì)，而對改善MP功能性質(zhì)的研究相對較少。本研究以豬肉MP為研究對象，探討5 種不同質(zhì)量濃度STP對MP功能特性的影響，并進行相關(guān)性分析，旨在為STP改善肉制品質(zhì)構(gòu)的作用機理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為肉制品加工提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬4號肉（從最后腰椎與薦椎間垂直切下并除去后肘的部分豬后腿部位肌肉） 北京市豐臺區(qū)永輝超市；乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）、NaCl、MgCl2、三氯乙酸、Na2HPO4、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、戊二醛、三氯甲烷、叔丁醇、溴酚藍、尿素（均為分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；BCA試劑盒 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LYNX 4000冷凍離心機 北京科德遠揚科技有限公司；XH-C旋渦混合器 江蘇省金壇市白塔新寶儀器廠；WFZ UV-20紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；AM-3均質(zhì)機 日本Nihonseiki Kaisha公司；PMT 49984酶標(biāo)儀 美國Biotek Instruments公司；TA-XT plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 MP提取

參考Xiong[9]的方法，并有所改動。取冷凍豬4號肉于4 ℃解凍后，用5 倍體積提取緩沖液（含0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EDTA-2Na和10 mmol/L Na2HPO4，pH 7.4）高速勻漿（10 000 r/min），7 600 r/min離心10 min，重復(fù)2 次得到粗MP；用5 倍體積pH 7.4的0.1 mol/L NaCl溶液高速勻漿（10 000 r/min），7 600 r/min離心10 min，重復(fù)3 次，最后1 次用4 層紗布過濾漿液，并用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0，最后7 600 r/min離心10 min得到沉淀，即為純化MP，4 ℃冰箱貯藏，備用。

用BCA試劑盒測定MP濃度。將提取的MP溶于0.6 mol/L NaCl溶液中，分別添加質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/100 mL的STP，以未添加STP的MP溶液為對照組，測定MP的乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性、起泡穩(wěn)定性、表面疏水性、凝膠強度和凝膠保水性。所有實驗均平行測定3 次。

1.3.2 MP乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定

參考Agyare等[10]的方法，并有所改動。將MP溶解在0.6 mol/L、pH 6.5的NaCl溶液中，配制成MP質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液；將2.0 mL大豆油和8.0 mL MP溶液在轉(zhuǎn)速10 000 r/min條件下高速勻漿1 min，立即從距杯底0.5 cm處取100 μL勻漿液加入到5 mL 0.1% SDS溶液中，振蕩混勻后用紫外分光光度計在500 nm波長處測定吸光度，記作A0；勻漿后10 min再次在相同位置取勻漿液100 μL，加入到5 mL 0.1% SDS溶液中，振蕩混勻后測定吸光度，記作A10，用0.1% SDS溶液作為空白對照組。MP勻漿液的乳化性和乳化穩(wěn)定性按照公式（1）～（2）計算。

式中：A500nm為樣品在500 nm波長處的吸光度；φ為油相體積分?jǐn)?shù)（φ＝0.25）；ρ為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（g/mL）。

1.3.3 MP起泡性及起泡穩(wěn)定性的測定

參考Wang Guang等[11]的方法，并有所改動，測定MP的起泡性和起泡穩(wěn)定性。取10 mL 5 mg/mL的MP溶液，在10 000 r/min條件下均質(zhì)2 min，迅速倒入50 mL量筒，讀取泡沫體積，靜置30 min后，再次讀取泡沫體積。起泡性和起泡穩(wěn)定性按照公式（3）～（4）計算。

式中：V為MP溶液體積/mL；V0為均質(zhì)2 min后泡沫體積/mL；V30為靜置30 min后泡沫體積/mL。

1.3.4 MP表面疏水性的測定

參考Chelh等[12]的方法，測定不同磷酸化程度MP的表面疏水性。取不同磷酸化程度的MP溶液2 mL，加入到10 mL離心管中，加入40 μL 1 mg/mL的溴酚藍溶液，室溫攪拌10 min，然后3 040 r/min離心15 min；取上清液在595 nm波長處測定吸光度，以未添加MP溶液的20 mmol/L、pH 6.0磷酸鹽緩沖液為空白對照，以與蛋白質(zhì)結(jié)合的溴酚藍質(zhì)量表示蛋白質(zhì)的表面疏水性。表面疏水性按照公式（5）計算。

式中：40為加入溴酚藍溶液的質(zhì)量/μg；A0為空白組吸光度；A為樣品吸光度。

1.3.5 MP凝膠強度的測定

參考趙冰等[13]的方法，并有所改動。將STP分別以質(zhì)量濃度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/100 mL添加至MP中，再添加一定量的0.6 mol/L NaCl溶液，使最終溶液體積與MP的質(zhì)量比為3∶2；攪拌均勻后離心（1 520 r/min、4 ℃、10 min）排除氣泡，25 ℃水浴中以1 ℃/min加熱至70 ℃后恒溫加熱30 min，迅速取出，冷水冷卻至室溫，放入4 ℃冰箱冷藏過夜，測定前將樣品在室溫條件下放置1 h，采用TA-XT Plus型質(zhì)構(gòu)儀進行凝膠強度測定。

質(zhì)構(gòu)儀參數(shù)設(shè)定：在弱凝膠強度模式下采集數(shù)據(jù)，探頭型號選擇P/0.5；實驗參數(shù)為：測試前速率1.0 mm/s，觸發(fā)力5.0 g，測試速率0.5 mm/s，返回速率10.0 mm/s，測試循環(huán)1 次，測試距離10 mm。

1.3.6 MP凝膠保水性的測定

參考趙冰等[14]的方法，并有所改動。將制備好的MP凝膠取出，在室溫（22±2） ℃條件下放置30 min；取5 g凝膠樣品離心（3 800 r/min、15 min），去除離心后水分，稱凝膠質(zhì)量。凝膠保水性按照公式（6）計算。

式中：ma為離心后凝膠質(zhì)量/g；mp為離心管質(zhì)量/g；mb為離心前凝膠質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以最小顯著性差異（least-significant difference，LSD）法（P＜0.05）進行數(shù)據(jù)間的顯著性分析，采用SPSS 19.0軟件進方差分析和Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MP的乳化性及乳化穩(wěn)定性

蛋白質(zhì)乳化作用主要是由于蛋白質(zhì)疏水基團具有親油性，可作為油和水之間的一個良好介質(zhì)，降低二者接觸時的表面張力，使油與水結(jié)合能力增強。乳化性越大，表明MP乳化能力越強，單位質(zhì)量乳化的油越多[15]。

由圖1可知，與對照組相比，添加STP后MP的乳化性顯著升高（P＜0.01）。STP質(zhì)量濃度為0.0～0.4 g/100 mL時，MP的乳化性逐漸增強，最高為（29.85±0.51） m2/g；STP質(zhì)量濃度為0.4～0.5 g/100 mL時，MP乳化性逐漸降低。Zorba等[16]研究磷酸鹽濃度對MP乳化性的影響，結(jié)果表明，MP的乳化性隨磷酸鹽含量增加而增強；與對照組相比，磷酸鹽添加量為0.50%和0.75%時，MP的乳化性分別提高22.3%和23.0%。本研究結(jié)果與其相符，可能是由于添加STP后MP上引入磷酸基團，改變蛋白質(zhì)構(gòu)象，使蛋白質(zhì)分子伸展，大量疏水基團暴露，與非極性油分子相連，而親水基團則和水分子相連，有利于形成更多較強界面膜，減少油滴聚集能力[17]。

乳化穩(wěn)定性是判斷蛋白質(zhì)乳化特性的主要指標(biāo)。乳化穩(wěn)定性可表征蛋白質(zhì)油-水混合體系對外界的抗應(yīng)變能力。乳化穩(wěn)定性越高，蛋白質(zhì)的抗應(yīng)變能力越強。

由圖2可知，與對照組相比，添加STP后MP的乳化穩(wěn)定性顯著升高（P＜0.01）。STP質(zhì)量濃度為0.2～0.5 g/100 mL時，隨其質(zhì)量濃度的升高，MP乳化穩(wěn)定性升高；STP質(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL時，MP乳化穩(wěn)定性最高，為（38.79±3.02）%。Yapar等[18]研究磷酸鹽對鯉魚魚肉乳化能力的影響，結(jié)果表明，乳化穩(wěn)定性隨磷酸鹽的增加極顯著增加。本研究結(jié)果與其相符。乳濁液中相鄰2 個界面膜之間磷酸基的靜電作用可以阻止乳濁液聚集，添加STP后，蛋白質(zhì)水化性增強，有利于液滴間的分散，從而增強體系穩(wěn)定性[19]。

2.2 MP的起泡性及起泡穩(wěn)定性

由圖3可知，與對照組相比，添加STP后MP的起泡性極顯著增加（P＜0.01）。STP質(zhì)量濃度為0.0～0.3 g/100 mL時，MP的起泡性逐漸增大，最高為（84.85±2.50）%；當(dāng)STP質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，MP的起泡性逐漸下降。蛋白質(zhì)起泡性由蛋白質(zhì)分子擴散、界面張力及疏水基團含量和分布等決定，隨著STP質(zhì)量濃度的增加，MP上結(jié)合的磷酸基團增加，使MP等電點降低，蛋白質(zhì)附帶更多負電荷，溶解度升高，起泡性增強[20-21]。

由圖4可知，與對照組相比，添加STP后MP的起泡穩(wěn)定性極顯著增加（P＜0.01）。隨著STP質(zhì)量濃度的增加，MP的起泡穩(wěn)定性逐漸增大，當(dāng)STP質(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL時，MP的起泡穩(wěn)定性最大，為（78.57±1.40）%。添加STP后MP引入磷酸基團，使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開，泡沫界面黏性增強，蛋白質(zhì)易于吸附在氣泡表面，氣泡致密均一、界面膜增厚，阻止了分子擴散[22-23]。

2.3 MP的表面疏水性

由圖5可知，與對照組相比，添加STP后MP的表面疏水基含量顯著降低（P＜0.01）。STP質(zhì)量濃度為0.0～0.4 g/100 mL時，隨著STP質(zhì)量濃度的增大，MP的表面疏水基含量逐漸降低，最低為（3.99±0.20） μg。這是由于磷酸化后MP電負性增加，溶解性增加，使蛋白質(zhì)分子展開，疏水基團暴露，增強了疏水基團與溴酚藍的結(jié)合能力，所測得的疏水基團含量降低[14]。表明磷酸化對MP結(jié)構(gòu)的改變產(chǎn)生了顯著影響，維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用力減弱[24]。

2.4 MP的凝膠強度

由圖6可知，與對照組相比，STP質(zhì)量濃度為0.1～0.5 g/100 mL時，MP的凝膠強度極顯著增強（P＜0.01）。STP質(zhì)量濃度為0.1～0.3 g/100 mL時，隨其質(zhì)量濃度升高，MP的凝膠強度增強；STP質(zhì)量濃度為0.3 g/100 mL時，MP的凝膠強度最大，為745.7 g。鄧麗等[25]研究表明，添加STP后MP引入磷酸基團，電負性增強，蛋白質(zhì)間靜電作用增加，蛋白質(zhì)相互交聯(lián)作用增強，分子間結(jié)合穩(wěn)定性增高，形成更加致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而使MP凝膠強度增大。本研究中，STP質(zhì)量濃度為0.3～0.5 g/100 mL時，隨其質(zhì)量濃度升高，MP凝膠強度降低，這可能是由于未與蛋白質(zhì)結(jié)合的STP較多，使整個體系pH值升高，分子間靜電力增大，影響熱誘導(dǎo)過程中蛋白質(zhì)的聚集，導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝膠強度降低[26-27]。

2.5 MP的凝膠保水性

由圖7可知，與對照組相比，STP質(zhì)量濃度為0.2～0.5 g/100 mL時，MP的凝膠保水性極顯著增高（P＜0.01）。STP質(zhì)量濃度為0.4 g/100 mL時，MP的凝膠保水性最高，為（77.8±1.10）%。這可能是由于MP引入磷酸基團，增加了蛋白質(zhì)分子的電負性，肌動球蛋白解離成肌球蛋白和肌動蛋白的速率增大，疏水基團增多，MP凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)空間增大，蛋白質(zhì)與水分子結(jié)合位點增加，使更多水分被保留下來[28-29]。STP質(zhì)量濃度為0.4～0.5 g/100 mL時，隨其質(zhì)量濃度升高，MP的凝膠保水性降低。這可能是由于STP質(zhì)量濃度過高引起蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)均一性變差，導(dǎo)致保水性下降[30]。

2.6 MP功能特性的相關(guān)性分析

表 1 MP功能特性的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of functional properties of MP

由表1可知，MP的起泡性、起泡穩(wěn)定性和乳化性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），乳化性與乳化穩(wěn)定性呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。Rodriguez等[31]認為，表面張力降低是蛋白質(zhì)乳化和起泡的首要條件，其下降程度能反映蛋白質(zhì)展開和重排能力的大小。闞健全[32]、Graham[33]等研究表明，蛋白質(zhì)的表面張力和表面張力變化率與乳化性和乳化穩(wěn)定性呈正相關(guān)，蛋白質(zhì)表面張力變化率與起泡性、起泡穩(wěn)定性呈正相關(guān)，蛋白質(zhì)變性會降低溶液表面張力。MP的起泡性、起泡穩(wěn)定性、乳化性、乳化穩(wěn)定性與表面疏水性均呈極顯著負相關(guān)（P＜0.01），與凝膠保水性均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），這可能是由于添加STP后MP的大量疏水基團暴露，使蛋白質(zhì)快速遷移到界面，形成穩(wěn)定界面薄膜，有利于乳狀液和泡沫形成，這與Nakai[34]的研究結(jié)果相符。而鄭文彬等[35]研究蕓豆蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的結(jié)果表明，乳化穩(wěn)定性與表面疏水性呈顯著負相關(guān)，可能是由于蛋白質(zhì)之間的相互作用降低了蛋白質(zhì)膜穩(wěn)定脂肪的能力。MP的表面疏水性與凝膠保水性呈極顯著負相關(guān)（P＜0.01），這可能是由于MP引入磷酸基團，疏水基團增多，MP凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)空間增大，蛋白質(zhì)與水分子結(jié)合位點增加，使更多水分被保留下來。周心雅等[36]研究表明，MP的表面疏水性與凝膠硬度和凝膠白度極顯著正相關(guān)，與MP的溶解度、乳化活性及凝膠保水性極顯著負相關(guān)，表明疏水基團暴露程度越大，MP的溶解度、乳化活性及凝膠保水性越差。MP的表面疏水性與凝膠強度呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），這可能是由暴露的疏水基團在凝膠形成過程中又被包裹在凝膠網(wǎng)絡(luò)中導(dǎo)致[37]。因此，改善MP的乳化性、起泡性和表面疏水性等界面性質(zhì)可增強其凝膠特性。

3 結(jié) 論

探討不同質(zhì)量濃度STP的添加對MP功能特性的影響，并進行相關(guān)性分析。結(jié)果表明：STP可以增強MP的功能特性，其質(zhì)量濃度為0.3～0.4 g/100 mL時效果最佳；改善MP的乳化性、起泡性和表面疏水性等界面性質(zhì)可增強其凝膠特性。