Nafamostat修復脊髓損傷的研究進展

高仕杰，石家曉，李波

天津醫科大學總醫院骨科 (天津 300052)

脊髓損傷是一種嚴重的、致殘率較高的疾病。目前針對脊髓損傷的修復研究面臨許多困難，如神經元的凋亡、機械屏障的生成、神經營養因子的缺失、抑制軸突再生的因素等。不同學者嘗試用不同方法克服以上困難。本研究就修復藥物Nafamostat修復脊髓損傷的效果進行綜述。

1 脊髓損傷后的微環境改變

脊髓損傷宏觀上是指外傷或者退行性病變等原因導致的脊髓壓迫及受損，為脊髓損傷的第一階段。在此基礎上，進一步引起鏈式反應，即第二階段，各種分子病理機制陸續產生，如離子穩態的失調、局部水腫、缺血、局部出血、氧化應激及細胞凋亡，在脊髓損傷的惡化過程中，它們起著重要的作用，為此引出了一個新的定義：脊髓損傷微環境。

脊髓損傷微環境受脊髓及脊髓周圍的各種細胞和相關因子同時影響。膠質瘢痕，是繼發性脊髓損傷后的標志，可將損傷中心與正常的脊髓組織分離開來。膠質瘢痕由反應性星形膠質細胞、少突膠質細胞前體細胞、小膠質細胞、巨噬細胞內皮細胞、成纖維細胞，以及這些細胞的細胞外基質混合而成。反應性星形膠質細胞，是脊髓損傷后膠質瘢痕的標志性細胞。目前反應性星形膠質細胞的啟動、維持和遷移的機制已經逐漸被發現。在許多細胞外因子中，轉化生長因子-β(TGF-β)、白細胞介素-1(IL-1)和干擾素-γ(IFN-γ)已經被證明可以觸發星形膠質細胞重新激活，mTOR-STAT3信號通路和BMP-mir-21軸也同樣被證明對于反應性星形膠質細胞的基因表達譜至關重要。干擾這些信號傳導中的任何一個都可以顯著減少脊髓損傷后膠質瘢痕的形成。反應性星形膠質細胞在脊髓損傷中是一把雙刃劍，在脊髓損傷早期，膠質瘢痕的形成起到一定的優勢作用，其可以將炎癥介質局限在一定的范圍內，限制病灶的擴張，減少正常組織的受損，促進血管生成和血腦屏障的再建，為神經元提供營養支持。然而在損傷過程中后期，膠質瘢痕則成為神經元軸突途徑中的重大阻礙。基于這一病理機制，脊髓損傷中后期抑制瘢痕形成，可以促進脊髓修復。

2 Nafamostat的作用機制

Nafamostat，別名Nafamostat Mesylate，分子式C19H17N5O2·2CH4O3S，是一種合成的蛋白酶抑制藥，上市于日本，廣泛地用于胰腺炎和彌散性血管內凝血患者的治療[1]，還可作為血液透析的抗凝血劑。其臨床應用取決于其對各種類型的絲氨酸蛋白酶(包括凝血酶因子Ⅸ,Ⅹ,Ⅻa,and Ⅶa)的活性抑制作用[2]。

目前，對Nafamostat的研究很多，從臨床應用到實驗研究，人們不斷挖掘Nafamostat在疾病治療中的潛力，并且進一步探尋其在疾病發展至治愈階段的作用機制。目前的基礎實驗研究表明，在膿毒性休克、心臟缺血再灌注損傷、移植物排斥反應和急性炎性疾病等多種病理條件下，一氧化氮(NO)或過氧亞硝酸鹽的產生與組織損傷有關[3]。在病理機制中NO參與了多種細胞類型的基質金屬蛋白酶(MMPs)的激活，包括人軟骨細胞、大鼠系膜細胞、人中性粒細胞和人血小板。MMPs的上調則可導致細胞外基質降解、炎性細胞外滲、血管生成和血小板聚集。Nafamostat可以明顯抑制NO的合成、炎癥反應的產生和細胞的凋亡[4]。這是由于Nafamostat的分子結構中具有胍基，這一結構特性使得Nafamostat可以競爭性抑制NO合成酶或者破壞其活性，從而影響NO的合成。同時，它還可以抑制由脂多糖(LPS)誘導的轉錄因子核因子-κB(NF-κB)，從旁路抑制NO合成酶的產生[5]。此外，Nafamostat還可以減少由LPS誘導的白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-8(IL-8)[6]。眾所周知，IL-8是激活多形核白細胞、增加血管通透性和誘導炎性新生血管的有力因子之一，IL-6是引起傳染病中血小板增多的因子。Nafamostat還可以抑制炎癥反應和微循環中血栓的形成。

Nafamostat在腦組織損傷修復方面也有相應的研究。有報道表明，血腦屏障(BBB)的破壞將導致腦水腫和出血，是腦卒中發病的重要因素[7]。現在越來越多的人支持這一理論，因此腦缺血后BBB損傷的減輕被認為可對神經進行保護。據報道，缺血性腦卒中后，在損傷的脈管系統，特別是缺血組織周圍血管處凝血酶水平增加，進一步激活內皮細胞凝血酶受體1(PAR1)而誘導內皮功能障礙[8]，調高蛋白激酶Ca(PKCa)的活性[9]，還可以使內皮RhoA活化[10]，這3點共同導致BBB完整性的破壞，意味著局部缺血和凝血酶是損傷血腦屏障的重要原因[11]。BBB由眾多的細胞和結構組成，包括內皮細胞、基底膜、星形膠質細胞和周圍細胞，是由相鄰內皮細胞的緊密連接及相關蛋白聯合作用形成，特別是緊密連接蛋白閉合蛋白和閉鎖小帶蛋白1(ZO-1)，其表達水平的高低直接影響內皮屏障的通透性[12]。PKC是一種家族蛋白，主要通過磷酸化蛋白的絲氨酸和蘇氨酸氨基酸殘基的羥基，參與控制該蛋白的功能，進而調節細胞內信號傳導，PKC家族中PKCa在內皮細胞滲透性的調整上起著一定的作用。RhoA，參與多種細胞程序，包括內皮細胞屏障的完整性和功能的調節[13]。大量數據表明，凝血酶可以促進RhoA連接其下游作用因子Rho-激酶，進而導致肌球蛋白輕鏈(MLC2)磷酸化和肌動蛋白纖維的形成，從而使BBB的滲透性隨之提高[14]。此外，RhoA的激活已被證明與緊密連接蛋白狀態有關[15]。為了證明Nafamostat對腦組織修復的有效性，采用動物體內及體外實驗進行驗證，經過Nafamostat處理過的大鼠，閉合蛋白和ZO-1的表達水平得到了提高，PKCa磷酸化的水平未見明顯增長，并減緩了Rho活性的增加，以及MLC2磷酸化和肌動蛋白纖維的形成。表明Nafamostat可通過抑制凝血酶減輕BBB的損害，進一步證明了Nafamostat可通過PKCa/RhoA/p-MLC2發揮作用，保護BBB完整性[16]。

隨著精準醫學的發展，人們的研究領域也在不斷拓寬，對于腦損傷后神經的修復，不再局限于凝血酶、炎癥介質，而是從細胞整體功能的研究，逐漸拓展到細胞器功能的探索。已有研究表明，內質網應激是促進凋亡信號和感知腦損傷的關鍵成分，在缺血誘導的神經元變性中起關鍵作用[17]。例如，缺血/再灌注損傷可誘導神經元在缺血區的凋亡和上調內質網應激標志物的表達，包括葡萄糖調節蛋白(GRP78)和CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CHOP)[18]。GRP78作為一個良性標志物，可以減少對CHOP的誘導、細胞的凋亡并阻止內質網的應激[19]。在短暫大腦中動脈閉塞(MCAO)的實驗中，Nafamostat抑制了CHOP的表達，還可通過抑制小膠質細胞和星形膠質細胞的活化增強神經細胞中GRP78的表達[20]。文獻[21]報道，CHOP的誘導主要通過未折疊的蛋白反應調控PERK-eIF2α-ATF4信號通路進行，我們檢測出在MCAO組中eIF2α表達上調，應用藥物治療后eIF2α表達受抑制，進一步證明了Nafamostat主要是抑制eIF2α來調控CHOP[20]。

以上實驗均證實了Nafamostat是一種很有潛力的藥物，可以治療缺血性腦卒中及修復神經元的損傷。

3 Nafamostat在脊髓損傷修復中的應用

有報道證明Nafamostat可增加同側海馬、對側和同側感覺運動皮層腦源性神經營養因子(BDNF)、神經生長因子(NGF)和神經營養因子3(NT3)的表達，激活TrkB/ERK1/2-CREB信號通路，抑制同側海馬和對側感覺運動皮質的Cdk 5活性，但不影響JNK和p38 MAPK的磷酸化。通過這些通路傳導及各類因子的釋放，對側皮質紅核束和皮質脊髓束中的纖維數目得以增加，同樣延長了皮質脊髓束纖維的總長度，同時增加了對側感覺運動皮質生長相關蛋白43(GAP-43)蛋白水平的表達。這些結果提示，Nafamostat能促進損傷對側皮質軸突再生，并支配同側紅核和脊髓運動神經元，同時也證明了Nafamostat在中樞神經疾病修復中可以起到一定的作用[22]。脊髓作為中樞神經中腦的延伸部分，擁有中樞神經的特性。脊髓損傷同樣也是中樞神經的損傷，脊髓的修復也就等同于軸突的再生及突觸的重塑，我們可根據Nafamostat在腦損傷中的應用，并根據其藥理機制和適應證，探尋脊髓損傷后的病理因素和微環境是否可以被Nafamostat抑制或者改善，從而使得脊髓損傷的患者得到功能康復。最近的實驗表明，Nafamostat能夠顯著促進脊髓損傷后大鼠的運動功能恢復，顯著增加灰質與白質組織，還能夠降低腫瘤壞死因子-α(TNF-α)與IL-6的表達，抑制脊髓損傷處凝血酶的表達，提高神經營養因子(NT-3、BDNF、NGF)的表達，起到調節脊髓損傷處微環境、改善功能與組織恢復的效果[23]。