葡萄汁酵母和植物乳桿菌混合發酵對葡萄酒發酵的影響

李憑，李彤，高瑩瑩，張翠英

(工業微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)

紅葡萄酒的釀造過程主要由酵母菌完成的酒精發酵(alcoholic fermentation, AF)和乳酸菌主導的蘋果酸-乳酸發酵(簡稱蘋乳發酵，Malolactic fermentation, MLF)兩部分組成。MLF是AF結束后，在乳酸菌的作用下將酒中的二元酸L-蘋果酸脫羧降解為一元酸L-乳酸和CO2而啟動的二次發酵[1-2]。MLF能夠降低葡萄酒的酸度，使新(生)葡萄酒的粗糙、酸澀等特征消失，酒體變得圓潤、柔和，同時還會通過乳酸菌自身的代謝活動釋放揮發性香氣，改善葡萄酒的風味，提高葡萄酒的質量[3-5]。

在AF結束后，酒體較高的酒精度、較低的pH值與殘糖量使乳酸菌發酵受到抑制，發酵周期延遲，故在發酵結束時由MLF產生的酯等風味物質含量減少，降低葡萄酒的風味質量[6];另外，在AF結束后，酒體中存在的噬菌體也會造成MLF推遲或被抑制，腐敗菌發酵產生異香和異味，導致葡萄酒病害的發生[7-8]。

植物乳桿菌是葡萄酒中進行MLF常見的乳酸菌之一，由于植物乳桿菌可以在葡萄酒高酒精含量、低pH值、高溫等苛刻的條件下生長，具有潛在啟動MLF的能力，成為近幾年研究的新一代可以代替酒類酒球菌的理想的MLF發酵劑[9-10]。本文通過對比分析于酒精發酵不同時間接入植物乳桿菌時，酵母和乳酸菌混合發酵對葡萄酒發酵周期和風味物質的影響，確定接入植物乳桿菌的最佳時間，從而提高葡萄酒的風味質量。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 菌株

本實驗室保藏的葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)編號為WY1；由實驗室從玫瑰香葡萄中篩選得到的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)編號為ZL1。無營養缺陷標記。

1.1.2 培養基

YEPD培養基：蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，pH自然，115 ℃滅菌20 min。

MRS培養基：葡萄糖20 g/L，酵母浸粉4 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L，胰蛋白胨15 g/L，醋酸鈉5 g/L，牛肉膏5 g/L，檸檬酸銨2 g/L，吐溫-80體積分數為0.1%，調節pH至4.8左右，121 ℃滅菌20 min。

發酵培養基：葡萄汁糖質量濃度為210 g/L。

1.1.3 儀器及試劑

FA2004電子天平，上海精密科學儀器有限公司；LRH-150生化培養箱，上海一恒科技有限公司；IS-RDS3恒溫搖床，上海制成儀器制品有限公司；YXQ-LS-75SⅡ高壓滅菌鍋，上海博訊實業有限公司；7890A氣相色譜儀，北京安捷倫科技有限公司；1100LC高效液相色譜儀，美國Agilent公司；L-蘋果酸試劑盒(Megazyme)，愛爾蘭Megazyme公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液培養

酵母：一級種子培養液，挑取1環酵母接種于裝有5 mL YEPD試管；二級種子培養液，將一級種子按5%(V/V)接到裝有50 mL YEPD液體培養基的三角瓶中，30 ℃，180 r/min，至細胞濃度2.0×109CFU/mL。

植物乳桿菌：一級種子培養液，挑取1環植物乳桿菌于裝有MRS培養基中培養至對數末期；二級種子培養液，以5%(V/V)接種量接種于50 mL培養基中，37 ℃靜置培養至細胞濃度1.2×107CFU/mL。

1.2.2 葡萄酒發酵

用蔗糖調節葡萄汁初糖濃度至210 g/L，用酒石酸調節pH至 3.51，SO2添加量為80 mg/L；將酵母種子培養液按5%(V/V)接種量接入裝有190 mL葡萄汁的250 mL三角瓶中，25 ℃生化培養箱中發酵，在酒精發酵第1天、第2天…第5天分別以5%(V/V)接種量接入植物乳桿菌ZL1。每1天的發酵做3個平行試驗。

1.3 分析方法

1.3.1 發酵速率的測定

CO2失重法：發酵過程中每隔24 h稱重并記錄數據，計算發酵瓶累積失重量(即CO2的釋放量)。然后以發酵瓶累積失重為縱坐標，發酵時間為橫坐標，繪制發酵速率曲線。

1.3.2L-蘋果酸含量測定

L-蘋果酸試劑盒(Megazyme)檢測：準備2個干凈試管，1根試管加入2.1 mL的蒸餾水(空白對照)，另外1根加入2 mL的蒸餾水和0.1 mL的發酵液(稀釋F倍)，分別依次加入0.1 mL的溶液1(緩沖液)、0.1 mL的溶液2(NAD+/PVP)和0.02 mL的溶液3 (草酰乙酸氨基轉移酶)，混勻后反應3 min，在335 nm波長處，用1 cm比色皿測定樣品吸光度A1，分別加入0.02 mL的溶液4(L-蘋果酸脫氫酶)，混勻后反應3 min，在相同條件下測定樣品吸光度A2。

ρ(L-蘋果酸)/(g·L-1)=0.498 0×(A2-A1)×F

(1)

1.3.3 pH值的測定

應用酸度計檢測發酵后發酵液的pH值。

電極活化：第1次使用或長期停用的酸度計電極，使用前在飽和的氯化鉀溶液中浸泡24 h,對電極進行活化。

標定：用蒸餾水清洗電極，插入已配好的pH值為6.86的緩沖溶液中，調節儀器使顯示讀數與該緩沖溶液當時溫度下的pH值相一致，然后用蒸餾水清洗電極后，插入pH值為4.01的標準緩沖溶液中，調節儀器使顯示讀數與標準緩沖溶液當時溫度下的pH值相一致。

樣品測定：蒸餾水清洗電極后用發酵液清洗2～3次，將電極插入發酵液中，玻璃棒攪拌溶液，在顯示屏上讀出發酵液的pH值。

1.3.4 酒精度的測定

應用酒精比重計法測定發酵后葡萄酒的酒精度：準確量取100 mL發酵液于1 000 mL的蒸餾瓶中，并同時加入等量的蒸餾水置于電爐上蒸餾，接入冷凝管，用冰浴的量筒收集100 mL餾出液后，測定酒精度和相應溫度，然后換算成20 ℃時的酒精度[11]。

1.3.5 還原糖的測定

斐林試劑法測定發酵液中還原糖的含量：

斐林試劑標定：吸取斐林試劑液(0.1 g/mL NaOH溶液)、乙液(0.05 g/mL CuSO4溶液)各5 mL，置于150 mL三角瓶中，準確加入10 mL蒸餾水，搖勻，待加熱至沸騰后，用1 g/L標準葡萄糖溶液滴定至藍色或紫紅色消失，記下滴定葡萄糖溶液的體積。

樣品測定：吸取斐林甲、乙溶液各5 mL于150 mL三角瓶中，加入1 mL樣品稀釋液和9 mL蒸餾水，其余操作同上。還原糖含量按公式(2)計算。

(2)

式中：X,樣品中還原糖的含量，g/L;V0,空白液消耗標準葡萄糖溶液的體積，mL；V,樣品稀釋液消耗標準葡萄糖溶液的體積，mL；ρ,標準葡萄糖溶液的質量濃度，g/L；n,樣品稀釋倍數；Vs,所取試樣稀釋液體積，mL。

1.3.6 風味物質的測定[6]

高效氣相色譜法：葡萄酒發酵液經蒸餾后采用氣相色譜法測定。內標物為乙酸正戊酯；色譜柱19091N-213：30 m×320 μm×0.5 μm，配FID檢測器；載氣為高純氮，流速2.5 mL/min。初始柱溫50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min的升溫速度升至80 ℃，保持2 min，最后以10 ℃/min的升溫速度升至100 ℃。檢測器溫度為250 ℃，進樣口溫度為230 ℃，進樣量0.4 μL，分流比20∶1。

1.3.7 有機酸的測定

高效液相色譜法：葡萄酒發酵液經0.22 μm的纖維濾膜過濾后用高效液相色譜測定。色譜柱為Bio-Rad HPX-87H，300 mm×7.8 mm；檢測器為示差折光檢測器(RID)；流動相為5 mmol/L硫酸，流速為0.6 mL/min；檢測器溫度為45 ℃，柱溫為65 ℃，進樣量為20 μL。

1.3.8 數據統計與分析

實驗取3次重復試驗平均值，數據以(平均值±標準差)形式表示，P<0.05表示差異有顯著性；并使用Origin 8.5和Excel分別進行圖和表的繪制。

2 結果與分析

2.1 發酵速率測定

發酵過程中每隔24 h稱重并記錄數據，計算CO2累積失重量(即發酵瓶累積失重量)。然后以CO2累積失重為縱坐標，發酵時間為橫坐標，繪制發酵速率曲線(如圖1)。

圖1 不同接菌時間下發酵速率比較
Fig.1 Comparison of fermentation speed of different
timing of bacterial inoculation

由圖1可知，隨著接種植物乳桿菌時間的延后葡萄酒發酵速率逐漸變慢，第1天接入植物乳桿菌時，葡萄酒發酵速率遠遠快于其他接菌時間的發酵速率，其中未加植物乳酸菌時發酵速率最慢(P<0.05)。因此，選擇在發酵第1天接入植物乳桿菌使酵母乳酸菌混合發酵，葡萄酒的發酵速率最快。

2.2 L-蘋果酸的變化趨勢

L-蘋果酸是葡萄酒產生強烈辛酸味的重要組分，且L-蘋果酸在葡萄酒發酵期間的變化是衡量蘋乳發酵是否完成的重要標準[12]，應用L-蘋果酸試劑盒(Megazyme)檢測發酵期間各發酵液中L-蘋果酸的含量，結果見圖2。

圖2 不同接菌時間對葡萄酒中L-蘋果酸的影響
Fig.2 Effect of different timing of bacterial inoculation
on theL-malic acid

由圖2看出，在葡萄酒發酵過程中，隨著接菌時間的延后，L-蘋果酸含量下降逐漸變慢，其中于第1天接入植物乳桿菌時，發酵液中L-蘋果酸含量降解速率最快(P<0.05)，在第15天，即可將發酵液的蘋果酸含量由最初的5.40 g/L降到1.30 g/L左右；而在第4天和第5天接入植物乳桿菌時，發酵液的L-蘋果酸含量在第30天降到2.35 g/L左右。隨著接入植物乳桿菌時間的延后，酵母AF產生的酒精量逐漸增加，殘糖量逐漸減少，pH值逐漸降低且酵母此時的發酵活力遠遠高于植物乳桿菌接入時的活力，這些條件都會對植物乳桿菌的發酵產生抑制，使MLF周期延長，L-蘋果酸降解速率變慢。由此可知在葡萄酒發酵第1天加入植物乳桿菌進行發酵，可以更好地發揮MLF的作用，加快發酵速率，縮短發酵周期。

2.3 殘糖量和酒精度的測定

按方法1.3測定發酵后各發酵液的殘糖、酒精度和pH值，結果如表1。

表1 不同接菌時間發酵性能比較Table 1 Comparison of fermentation performances of yeast strains

在第1天至第4天接入植物乳桿菌的發酵液與未加植物乳桿菌的發酵液相比殘糖量和酒精度含量偏低，其中第1天接菌的酒樣殘糖量與酒精度最低(P<0.05)。酵母AF主要是一個耗糖的過程，而植物乳桿菌發酵除了降解蘋果酸，也會在無氧條件下消耗一部分糖而生成乳酸，在第1天接入植物乳桿菌時，受酵母發酵的影響較小，菌活性較高、發酵能力強，因此消耗的糖分較多，進而使得酵母AF后產生的酒精含量偏低。同時通過測定各發酵液的pH值發現，加入植物乳桿菌發酵與不加植物乳桿菌發酵相比，發酵液的pH值明顯提高(P<0.05)。加入植物乳桿菌進行MLF，將酸性尖銳的蘋果酸轉變為酸味柔和的L-乳酸，該過程1 g的蘋果酸生成0.67 g乳酸，發酵液的pH值升高。在第1天至第5天分別加入植物乳桿菌的酒樣中，發酵液的pH值由大變小，隨著AF的進行，發酵液酒精度逐漸升高，殘糖量逐漸變小，此時加入的植物乳桿菌發酵受抑制，使MLF的降酸效果變差。

2.4 有機酸的測定

使葡萄酒具有酸性特征的有機酸類是葡萄酒的主要組分，有機酸類的性質及其濃度調節著發酵液的“酸堿平衡”，影響葡萄酒的口感、色澤及生物穩定性，進而影響葡萄酒的質量。對于紅葡萄酒來說，總酸量低，則酒體柔和、圓潤，相反總酸量高，則酒體粗糙，酸澀[13-14]。發酵后各發酵液中有機酸的含量測定結果見表2。

表2 不同接菌時間發酵液中有機酸的含量Table 2 Effect of different timing of bacterial inoculation on the organic acid

由表2看出，與未加ZL1菌相比，在MLF后：蘋果酸、檸檬酸明顯下降，其中第1天加入植物乳桿菌，發酵后兩者含量下降最多(P<0.05)；酒石酸和琥珀酸略有下降，第1天加入植物乳桿菌發酵后發酵液中酒石酸和琥珀酸變化最大(P<0.05)；乙酸含量略有增加(P<0.05)。MLF主要是在植物乳桿菌的作用下將具有強烈辛酸味的二羥基酸-蘋果酸分解成酸味柔和的單羥基酸-乳酸，使得MLF后L-蘋果酸含量下降，L-乳酸含量上升[13]。

對比未加植物乳桿菌的發酵情況(發酵后L-蘋果酸含量為4.219 g/L，檸檬酸含量為0.258 g/L，L-乳酸含量為0.171 g/L)，加入植物乳桿菌進行MLF，L-蘋果酸和檸檬酸含量降低，L-乳酸含量增加：在第3天、第4天和第5天加入植物乳桿菌時，發酵后L-蘋果酸含量分別為1.875、2.131和2.332 g/L，檸檬酸含量分別為0.223、0.206和0.220 g/L，L-乳酸含量分別為0.842、0.464和0.363 g/L，而第1天和第2天加入植物乳桿菌，發酵后L-蘋果酸和檸檬酸含量明顯降低(P<0.05)，L-乳酸含量明顯增高(P<0.05)。尤其是在第1天加植物乳桿菌后，發酵后發酵液的L-蘋果酸含量為1.307 g/L，檸檬酸含量為0.087 g/L，L-乳酸含量為2.164 g/L。而3種有機酸的酸味強弱的排列次序為蘋果酸>檸檬酸>乳酸，故發酵第1天接入植物乳桿菌時，酵母和植物乳桿菌同時發酵，植物乳桿菌受到AF的抑制作用較小使得MLF作用更強，從而對葡萄酒的降酸效果更好。

2.5 風味物質含量的測定

發酵后各發酵液中風味物質的含量，結果見圖3。

圖3 不同接菌時間的發酵液中風味物質含量的測定
Fig.3 Effect of different timing of bacterial inoculation on
the production of higher alcohols (A) and ester (B)

分別在第1天至第5天接植物乳桿菌進行發酵，發酵液中的高級醇含量逐漸增大，酯含量逐漸變小。其中第1天接入植物乳桿菌進行發酵，發酵后高級醇的含量最低(P<0.05)，即正丙醇含量為34.016 mg/L、異丁醇為24.431 mg/L、異戊醇為202.018 mg/L和苯乙醇為12.749 mg/L。高級醇是酵母AF的主要副產物，也是葡萄酒主要的風味物質，而過量的高級醇會給葡萄酒帶來異味，并易使人頭疼和醉酒。在糖發酵時接入植物乳桿菌，酵母和植物乳桿菌相互競爭，酵母可利用的糖分變少，發酵后高級醇的含量變低；因AF尚未完成，植物乳桿菌發酵受到的抑制作用較小，使得MLF比常規的順序發酵發酵能力更強，較多的蘋果酸降解為乳酸，進而生成乳酸乙酯,尤其是在第1天接入植物乳桿菌時，發酵后乳酸乙酯的含量達到24.313 mg/L，同時乙酸異戊酯的含量也略有提高。酯含量是葡萄酒風味物質的重要來源，較高的酯含量對葡萄酒的風味質量起到非常重要的作用。

3 結論

本研究通過在酒精發酵不同時間接入植物乳桿菌，使酵母和乳酸菌混合發酵，平衡酒精發酵和蘋乳發酵的作用，研究其對葡萄酒發酵性能的影響。通過比較發現，加入植物乳桿菌進行發酵，能夠降低葡萄酒的酸度，使新(生)葡萄酒的粗糙、酸澀等特征消失，使酒變得圓潤、柔和。與常規發酵相比，選擇在第1天接入植物乳桿菌，使葡萄汁酵母和植物乳桿菌混合發酵，由于酵母和植物乳桿菌相互競爭，酵母可利用的糖分變少，發酵后高級醇的含量變低，且因AF尚未完成，植物乳桿菌發酵受到的抑制作用較小，使得MLF比常規的順序發酵發酵能力更強，較多的蘋果酸降解為乳酸，進而生成更多的乳酸乙酯，起到了更好的降酸效果。故葡萄汁酵母和植物乳桿菌混合發酵在縮短發酵周期的同時，可提高葡萄酒的風味。