咸鰳魚中產組胺菌的分離與鑒定

吳佳佳，王思齊，戴志遠*

1(浙江工商大學 海洋食品研究院，浙江 杭州，310012) 2(中國計量大學 生命科學學院，浙江 杭州，310018)

全球大部分海產品消費引發的中毒事件中，組胺中毒事件占據較高比例且發生較為頻繁[1-2]。低劑量的組胺不對人體造成傷害，但當機體攝入超過100 mg時，即可引起過敏性食物中毒，急重患者出現暈厥、血壓降低，重癥可致死亡[3]。金槍魚、鯖科魚等富含組氨酸的青皮紅肉魚類組胺超標事件最為頻發，此外，魚醬、魚肉腸、咸魚等發酵水產品也極易富集組胺。因此，世界各國都對水產品中的組胺制定了嚴格的限量標準[4]。

食品中組胺的積累來自于細菌分泌氨基酸脫羧酶對食品基質中組氨酸的降解。水產品中含量豐富蛋白質降解生成的多肽、氨基酸則為組胺生成菌的活動提供了前體物質，而魚體攜帶的革蘭氏陰性菌嗜溫腸道菌、海洋微生物則是主要的組胺生成菌[5]。研究表明，分離自水產品的摩氏摩根菌(Morganellamorganii)、產氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、植生拉烏爾菌(Raoultellaplanticola)和發光桿菌(Photobacteriumdamselae)、蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundi)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)等細菌發酵液均有含量較高的組胺檢出，部分菌株發酵液組胺積累量高于1 000 μg/mL[6]。與此同時，發酵肉制品和水產品當中，乳酸菌(lactic acid bacteria)、凝固酶陰性的葡萄球菌(coagulase-negative staphylococci，CNS)等發酵微生物中也存在相當數量的組胺生成菌[7]。腌魚產品生產多數伴隨著微生物大量繁殖，因而腌魚產品中存在更大的生物胺超標風險。KORAL等調查了來自土耳其和歐洲國家的78個咸魚產品中生物胺含量，結果表明大約10%的樣品超過FDA和EU(歐洲聯盟)規定的組胺水平[8]。MOHAMED等研究發現在埃及腌魚貯存過程中，其生物胺總體含量從最初的84 mg/kg上升到了1 633 mg/kg[9]。

咸鰳魚又名三抱鰳魚、鰳鲞，是流行于舟山、寧波、紹興、杭州、蕭山等浙東地區的傳統腌魚制品。傳統咸鰳魚加工是以新鮮的鰳魚為原料，不去除魚鱗、魚鰓及內臟，經3次加鹽腌制而成。自然發酵的水產品因其風味獨特而備受消費者青睞，其獨特的風味與原料、工藝以及來自生產原料及環境的繁雜微生物群系息息相關。然而，在發酵微生物大量繁殖的同時，腐敗菌、致病菌及產組胺菌也會隨之滋生，進而降低其食用安全性[11]。本研究以傳統工藝腌制咸鰳魚為研究對象，對其腌制過程中產組胺菌進行分離鑒定，從基因水平檢測了其組氨酸脫羧酶攜帶情況，初步評估了其代謝過程中積累組胺的能力。研究結果將為科學評價自然發酵咸鰳魚發酵微生物的安全性、篩選安全的生產菌株提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

組胺生成菌分離瓊脂(histamine-forming bacteria isolation agar, HBI)[11](g/L)：L-組氨酸18.5、蛋白胨5.0、酵母浸粉5.0、NaCl 5.0、CaCO31.0、溴甲酚紫0.06，瓊脂20，pH值5.3±0.2。

胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養基(北京陸橋技術股份有限公司)，用于組胺產生菌的培養。

TSBH培養基(g/L)：TSB 38，L-組氨酸20；用于組胺菌的擴大培養及組胺的生成。

細菌基因組提取試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)；組胺標準品(Sigma-Aldrich，美國)；丹磺酰氯(上海生工生物技術服務有限公司)；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)等其他試劑：國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

1.2 主要儀器

壓力滅菌鍋，上海三申醫療器械有限公司；超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；恒溫培養箱，上海博訊實業有限公司；離心機，Eppendorf 5417R；電泳系統，Tanon EPS600；凝膠呈像系統，Tanon 3500；高速PCR儀，美國賽默飛世爾公司；Milli-Q Reference超純水系統，美國Millipore公司；C18色譜柱，Agilent，4.6 mm×150 mm，5 μm；高效液相色譜儀，waters 2695；PDA檢測器，waters 2996。

1.3 方法

1.3.1 咸鰳魚腌制及樣品采集

鰳魚腌制：冰鮮鰳魚，購于舟山。腌制方法參考ZHANG[10]，新鮮鰳魚流水沖洗干凈，不去內臟、魚鱗及魚鰓，分別于腌制第0、5、30天加入魚體重10%、20%、20%的食鹽進行鰳魚腌制。

樣品采集：分別在0(鮮魚)、1、6、11、41天取魚，每個時間段樣品采集3尾。無菌條件下，采鰳魚背部和腹部魚肉，剪碎后將同一時期3尾魚魚肉混勻。

1.3.2 菌株篩選及鑒定

稱取25 g魚肉樣品至含125 mL生理鹽水的錐形瓶中，振蕩混勻后制備梯度稀釋液，稀釋液涂布于HBI培養基平板，30 ℃培養72 h，挑選使培養基變成紫色的菌落，進行2次劃線分離純化。純化后的菌株接種于TSB中，30 ℃培養48 h后，制備30%甘油菌液，-80 ℃凍藏備用。

取TSB肉湯活化好的菌液2 mL，按照試劑盒說明書操作，提取菌株基因組DNA。參考袁開等[12]方法，對分離菌株16S rDNA序列進行擴增，擴增產物測序工作由南京金斯瑞生物科技有限公司完成，基因序列于GenBank中進行BLAST比對，并采用MEGA 4.0軟件構建系統發育樹。

1.3.3 產生物胺基因的克隆及序列分析

以分離菌株基因組DNA為模板，采用JAW等[3]設計的引物和PCR程序對組氨酸脫羧酶(histidine decarboxylase gene，hdc)基因進行擴增，預期片段大小1 383 bp。

UNI-L：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，

UNI-R：5′-GTGTGACGGGCGGTGTGTAC-3′

PCR擴增體系為25 μL體系：10×PCR Buffer(Mg2+plus) 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP mixture 2 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、DNA模板1 μL、5 U/μLTaq酶0.2 μL、加無菌去離子水補至25 μL。

PCR程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，在55 ℃下復性30 s，72 ℃延伸1 min，總計35個循環；最終72 ℃延伸7 min。

取PCR產物2 μL，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳20 min后于凝膠呈相系統下檢測。

1.3.4 發酵液組胺含量分析

活化后的菌種在600 nm條件下調整其吸光值為1.0，量取50 μL菌液接種于5 mL TSBH培養基中，30 ℃培養48 h后，取3 mL菌液，8 000 r/min下離心10 min，取上清液2 mL，參考JEONG等[7]方法進行衍生化處理進行液相色譜檢測，經PDA檢測器采集數據。同時，分別配制10、20、40、80、160、320、640 μg/mL組胺鹽酸鹽標準溶液，按上述衍生方法及色譜條件進行測定將組胺鹽酸鹽標準品濃度和對應的峰面積數值利用Origin(V6.0)軟件進行線性擬合，繪制標準曲線。依據標準品擬合的線性方程y=14.734x+2.2725，R2=0.999 8，計算分離菌株發酵液中組胺含量[7]。發酵液中組胺含量測定結果用Origin(V6.0)軟件、根據格拉布斯準則剔除異常數據后，根據擬合方程求出組胺含量。

2 結果與分析

2.1 產組胺菌的篩選及鑒定

參考楊健等[14]的方法，將5個腌制時期(0、1、6、11和41 d)的鰳魚樣品稀釋液涂布于HBI平板，30 ℃培養72 h。產組胺微生物能夠降解培養基中的組氨酸生成組胺，組胺的積累導致環境pH值升高進而使培養基中的溴甲酚紫指示劑變色，如圖1。通過肉眼觀察菌落，判定使平板變為藍紫色的菌株為產組胺陽性菌，每個樣品的篩選平板中隨機挑選10株疑似陽性菌，合計50株菌，經2次劃線純化后得到32株可培養菌株。

圖1 產組胺表型陰性菌與陽性菌
Fig.1 Non-histamine producing isolate and histamine
producing isolates

分離菌株的16S rDNA測序信息提交至GeneBank，Blast比對結果顯示分離菌株序列與已知菌株同源性均達99%，部分序列提交至GeneBank獲取登錄號，MH491949～MH491966。鑒定結果顯示，共分離到3個屬8個不同種的細菌，見表1。除了鮮魚樣品(0 d)檢出枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和糞嗜冷桿菌(Psychrobacterfaecalis)外，1、6、11、31 d腌魚樣品分離菌株均為葡萄球菌(Staphylococcusspp.)，葡萄球菌屬細菌共計29株，占分離菌株的90.63%，推測其為腌魚中產組胺的優勢菌屬。腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)是咸鰳魚中數量最多的疑似產組胺菌，研究顯示，腐生葡萄球菌也是許多自然發酵肉制品中的優勢固有菌[15]。

表1 產組胺菌16S rDNA測序結果Table 1 Sequencing and identification results of the histamine producing isolates

注：黑體標注菌株未檢出hdc基因，下劃線標注菌株發酵液中未檢測出組胺。

盡管研究證實具備腐生葡萄球菌較高SOD和過氧化氫酶活性，在肉制品發酵和后熟過程中能夠有效抑制脂肪氧化異味的產生，但因其與表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、科氏葡萄球菌(S.cohnii)在臨床上均被列為條件致病菌，所以發酵肉制品生產中不建議使用該菌種[16]。馬胃葡萄球菌(S.equorum)是自然發酵魚肉制品中固有優勢菌的主要成員之一，發酵過程中水解脂肪、蛋白質，進而促進產品風味的形成，其中一些菌株也被開發為商品化發酵劑[17]。尼泊爾葡萄球菌(S.nepalensis)和松鼠葡萄球菌(S.sciuri)也是許多自然發酵水產品中分離到的菌種，前者用作日本魚醬生產時能夠有效改善產品的風味[18]。

基于葡萄球菌分離菌株的16S rDNA信息，以NCBI數據庫中已有的相應模式菌株序列做參照，同時，以與葡萄球菌屬親緣關系較近的溶酪大球菌(Macrococcuscaseolyticus)作為外圍參照，采用Mega 6.0軟件、選擇Neighbor-Joining法構建系統發育樹，見圖2。分離菌株均與模式菌株能夠較好地聚為一群，外圍參照菌株獨立為一群。

圖2 葡萄球菌分離菌株基于16S rDNA序列的進化樹
Fig.2 Phylogenetic tree of the staphylococci based on
16S rDNA gene

2.2 hdc基因擴增及部分測序結果

圖3為分離菌株hdc基因PCR擴增結果，32株分離菌株中，24株(占分離菌株的75%)擴增出長度1 380 bp左右的hdc基因片段，與預期目標條帶大小一致。共8株分離菌株未檢測到hdc基因，其中包括5株腐生葡萄球菌、2株松鼠葡萄球菌和1株馬胃葡萄球菌，見表1。隸屬于同一個種的分離菌株攜帶hdc基因情況存在較大差異。

1-3: 1-5、1-6、1-9；4-7: 2-1、2-3、2-4、2-5；8-12: 3-2、3-3、3-8、3-9、3-10；13-20: 4-1、4-2、4-4、4-5、4-6、4-7、4-8、4-10；21-24: 5-3、5-4、5-5、5-6；M-DL-2000 DNA ladder圖3 分離菌株hdc基因擴增子結果電泳圖Fig.3 Electrophoresis results of hdc amplicons

2.3 分離菌株發酵液組胺含量測定結果

采用高效液相色譜法對分離菌株發酵液中組胺含量進行了測定，結果顯示，23株分離菌株的發酵液中均測出了不同濃度的組胺含量，產組胺菌發酵液組胺平均含量達38.10 μg/mL。產組胺量超過40 μg/mL的菌株共10株，其中4株發酵液組胺含量超過了50 μg/mL。腐生葡萄球菌分離菌株3-8發酵液中組胺濃度高達100.21 μg/mL，是分離菌株中組胺積累能力最強的菌株(圖4)。

圖4 產組胺菌株發酵液中組胺含量
Fig.4 Average histamine production of the isolates

結合基因檢測結果分析，19株(59.3%)攜帶產生物胺基因的分離菌株其發酵液組胺檢測結果為陽性，其基因型和表型相一致，涵蓋了除表皮葡萄球菌、枯草芽孢桿菌以外所有種屬的多數分離菌株。4株分離菌株既未攜帶組胺脫羧酶基因，其發酵液也未檢出組胺。然而，在初篩過程中，上述菌株均能使HBI平板變色，推測其能代謝產生組胺以外的堿性物質。5株分離菌株攜帶產組胺基因但其發酵液中卻未檢出組胺。4株腐生葡萄球菌分離菌株(3-6、5-1、5-7、5-8)未擴增出組氨酸脫羧酶基因，但其發酵液中卻存在組胺的積累，推測該菌株的組胺脫羧酶基因可能位于細菌質粒DNA中。本研究以細菌基因組DNA為模板進行hdc基因擴增，遺漏了可能存在于質粒DNA當中的hdc基因。

3 討論

HBI培養基是由美國學者NIVEN等研制產組胺菌的篩選培養基，最早用來篩選和分離產組胺細菌，但后續研究發現，HBI培養基也可篩選出其他生物胺產生菌，因此，篩選出來的菌株中可能不僅存在產組胺菌，還存在其他的生物胺產生菌[19-20]。本研究中，從HBI平板上篩選的陽性菌株中，23株分離菌株發酵液中有組胺檢出，其中，19株分離菌株產組胺的基因型和發酵液組胺積累表型一致；4株分離菌株既未檢出hdc基因，其發酵液中也未檢出組胺。因而，后續研究中，需要對HBI分離菌株產酪胺、尸胺、腐胺、苯乙胺等其他種類生物胺的能力進行更加全面的評估。

與人工接種發酵劑、工業化生產的肉制品相比較，沿襲傳統工藝、手工制作的自然發酵魚肉制品更具獨特的風味品質[15]。然而，自然發酵肉類發酵菌株通常會存在某些安全隱患，諸如雜菌滋生、產生物胺微生物滋生或病原微生物滋生等。本研究從不同腌制階段咸鰳魚中分離到32株產組胺細菌，盡管其中優勢葡萄球菌屬菌株大多是自然發酵水產品的固有菌，但其產組胺潛在危害卻應引起重視。23株分離菌株發酵液檢出組胺，其平均含量達38.10 μg/mL，1株腐生葡萄球菌發酵液組胺積累量高達100.21 μg/mL。

盡管許多凝固酶陰性的葡萄球菌如木糖葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、琥珀葡萄球菌(S.succinus)已被廣泛應用于發酵肉制品生產[10]，然而，由于編碼氨基酸脫羧酶基因的質粒不穩定，微生物的氨基酸脫羧酶的種類和效力差異很大。本研究分離到的3株馬胃葡萄球菌中，2株既攜帶hdc基因，同時其發酵液組胺含量也均超過了40 μg/mL。因此，微生物產生生物胺的能力是菌株特異性而非種屬特異性[21]。由此可見，抑制發酵過程中腐敗菌滋生的同時，準確掌握發酵微生物的遺傳背景信息，篩選不產生物胺的發酵菌株應用于生產，或通過控制生產條件抑制產生物胺微生物的活動，對有效降低腌魚產品中生物胺含量、保障腌魚產品食用安全具有重要現實意義。