高通量測序分析玉米秸稈與牛糞聯合發酵階段微生物多樣性變化

王旭輝，徐鑫，寶哲，王卉，葉凱，李冠*，鄧宇

1(新疆大學 生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊，830046)2(新疆農業科學院 生物質能源研究所，新疆 烏魯木齊，830091)3(新疆農業科學院 糧食作物研究所，新疆 烏魯木齊，830091)4(農業農村部農業生態與資源保護總站，北京，100125) 5(農業農村部沼氣科學研究所，四川 成都，610041)

我國具有豐富的生物質資源，包括農業、林業等產業的殘留物及其副產品，工業及市政中可生物降解的廢棄物等[1-2]。農業廢棄物占整個生物質能源的21%，其中主要有秸稈等纖維素生物質，畜禽糞便以及水果蔬菜在貯存、運輸、加工中產生的廢棄物[3-6]。這些生物質資源富含有機物，可用于生產沼氣、還田施肥、飼料加工等[7-8]。然而這些資源并沒有得到有效利用，大部分的農作物秸稈被直接燃燒、丟棄，造成嚴重的大氣污染和資源浪費現象[9-10]。通過秸稈混合糞便的沼氣工程不但可以解決秸稈廢棄物的再利用問題，避免了燒荒帶來的環境問題和資源浪費，還能調節能源結構、減少化石能源的消耗，找到了解決清潔能源發展的新突破口，促進了種、養殖業的協調發展和我國生物質資源的循環利用，對實現農業的可持續發展具有重要意義[11-14]。

沼氣工程是畜禽養殖場糞便秸稈廢棄物污染治理的最主要解決辦法[15-17]。國內外相繼開展了糞便與秸稈聯合發酵的研究，MICHAL[18]認為玉米秸稈和糞便的協同作用可以提高厭氧發酵能力，增加沼氣產量。李軼冰[19]等研究了溫度對玉米秸稈和糞便混合發酵的影響，發現溫度與發酵速率和累積產氣量呈正相關。MARCIN[20]等研究了經預處理后的秸稈與牛糞聯合發酵，相比于單牛糞原料發酵沼氣產率每天增加速率為177mL/mgVS。LUO[21]等研究了牛糞與玉米秸稈混合發酵工藝，發現混合原料產氣速率和產沼氣總量明顯的高于單一原料。周莎[22]等研究發現，當雞糞與小麥秸稈的混合比例為1∶1時，甲烷的產氣量達到90.56mL/gVS。劉永[23]通過牛糞和水稻秸稈混合發酵的研究，發現當牛糞和水稻秸稈以1∶1混合時，最大產氣率可達到398mL/gVS。FENG[24]通過采用不同秸稈和雞糞混合進行聯合發酵，玉米秸稈與雞糞以3∶1比例混合后，共消化產氣效果最好，通過高通量測序分析發現，共消化過程中的主要微生物為廣古菌、擬桿菌和厚壁菌。這些研究結果表明，通過多種方法利用糞便與秸稈聯合發酵提高沼氣發酵效率是沼氣工程的重要發展方向。

沼氣工程獲得高效產出，除了固定的發酵原料，高效的沼氣微生物種群也是沼氣池穩定高效運行的關鍵[25-28]。沼氣發酵過程是一個極其復雜的過程，包括水解階段、產酸階段和產甲烷階段，在不同階段中微生物菌群結構也不同，因此有必要采用現代分子生物學技術深入研究發酵過程中微生物的群落結構[29-30]。高通量測序技術是目前應用最普遍的新一代測序技術。它在分析微生物的群落結構時有著獨特的優勢，能夠通過從環境樣本中直接獲取的總DNA進行文庫構建并測序[31]，用16SrRNA基因的測序數據估計微生物群落的物種構成，能更加真實地揭示原位環境中微生物群落的復雜性和多樣性[32-35]。SONG等[36]對沼氣發酵過程中高通量測序的結果表明，微生物群體從乙酰梭菌產甲烷菌轉移到營養型甲烷菌和甲烷球菌。滑留帥等[37]對牛糞堆肥發酵過程添加益生菌劑，通過高通量測序表明變形菌門細菌顯著增加，說明菌劑的添加可以顯著改變微生物種群群落。

本研究以玉米秸稈-牛糞沼氣發酵為對象，以沼氣產量為指標篩選高效微生物菌劑，利用高通量分子技術對添加高效微生物菌劑的不同發酵階段牛糞沼液細菌和真菌優勢菌群多樣性變化規律進行分析，研究常溫條件下牛糞秸稈沼氣發酵細菌和真菌優勢菌群多樣性變化規律，為新疆地區牛糞秸稈沼氣發酵菌劑的制備提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗原材料與試劑

玉米秸稈來自新疆農業科學院生物質能源研究所瑪納斯試驗基地，風干、粉碎至粒徑≤4 mm，通過堿液對秸稈進行預處理。添加菌劑為實驗室自制秸稈專用微生物菌劑[38]，菌劑含有蠟樣芽孢桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌、松嫩假單胞菌。菌劑1中蠟樣芽孢桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌、松嫩假單胞菌(質量比3∶2∶3∶2)，菌劑2中蠟樣芽孢桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌、松嫩假單胞菌(質量比4∶3∶3∶2)，菌劑3中蠟樣芽孢桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌、松嫩假單胞菌(質量比2∶1∶2∶1)。

1.2 主要實驗儀器和試驗裝置

UVmini-1240紫外可見分光光度計,日本島津公司；安捷倫GC 6890N,美國安捷倫公司。本試驗所用裝置主要由厭氧發酵裝置、集氣裝置及控溫裝置3 部分組成。發酵裝置采用500 mL的廣口瓶，用橡膠塞密封，再用玻璃管與乳膠管相連接，集氣裝置由乳膠管與集氣袋連接而成，恒溫水浴鍋控制廣口瓶中發酵料液溫度。

1.3 分析方法

水分測定采用105 ℃恒重法[39]；纖維素含量、半纖維素含量、木質素含量采用范氏法測定[40-41]。沼氣中的CH4采用氣相色譜分析，設備配置為熱導檢測器，載氣為氮氣，流量設為30 mL/mm，進樣口、柱箱和檢測器溫度分別為120、100、120 ℃。

1.4 試驗設計

1.4.1 不同秸稈預處理效果比較

(1)空白處理：稱取粉碎后的玉米秸稈粉25 g加入500 mL預處理罐中，加入150 mL的蒸餾水放入水浴鍋中，溫度為35 ℃，預處理48 h。

(2)對照處理：稱取粉碎后的玉米秸稈粉25 g加入500 mL預處理罐中，加入150 mL的蒸餾水放入超聲波儀中，超聲30 min，放入水浴鍋中，溫度為35 ℃，預處理48 h。

(3)堿液處理：稱取粉碎后的玉米秸稈粉25 g加入500 mL預處理罐中，加入150 mL的蒸餾水放入超聲波儀中，超聲30 min，加入5 g NaOH，放入水浴鍋進行堿預處理，溫度為35 ℃，預處理48 h。

1.4.2 不同微生物菌劑的產氣效果比較

(1)空白處理：稱取自然晾干，粉碎后的牛糞150 g裝于2 L模擬發酵瓶中，加入預處理后的秸稈粉50 g，最后加去離子水1 500 mL混勻，連接集氣裝置，置于25℃恒溫培養，調整pH值至7。在發酵的每天上午10點記錄沼氣產量和甲烷產量。

(2)微生物菌劑1處理：稱取自然晾干，粉碎后的牛糞150 g裝于2 L模擬發酵瓶中，加入預處理后的秸稈粉50 g，再加入0.25 g微生物菌劑1，最后加水1 500 mL混勻，連接集氣裝置，置于25 ℃恒溫培養，調整pH值至7。在發酵的每天上午10點記錄沼氣產量和甲烷產量。

(3)微生物菌劑2處理：稱取自然晾干，粉碎后的牛糞150 g裝于2 L模擬發酵瓶中，加入預處理后的秸稈粉50 g，再加入0.25 g微生物菌劑2，最后加水1 500 mL混勻，連接集氣裝置，置于25 ℃恒溫培養，調整pH值至7。在發酵的每天上午10點記錄沼氣產量和甲烷產量。

(4)微生物菌劑3處理：稱取自然晾干，粉碎后的牛糞150 g裝于2 L模擬發酵瓶中，加入預處理后的秸稈粉50 g，再加入0.25 g微生物菌劑3。最后加水1 500 mL混勻，連接集氣裝置，置于25 ℃恒溫培養，調整pH值至7。在發酵的每天上午10點記錄沼氣產量和甲烷產量。

1.4.3 微生物總DNA的提取與純化

選擇產氣效果最好的處理組進行不同發酵時期的高通量微生物測序。提取發酵0天，15天，30天樣品，使用糞便基因組提取試劑盒(天根DP328，中國)完成沼液樣品中細菌DNA 的提取。所有樣品的細菌16S rRNA基因的V3-V4區域擴增用引物338F (5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)進行擴增。所有樣品的真菌ITS1區擴增用引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和引物ITS2R (5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)進行擴增。

使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒完成(天根DP209，中國)PCR產物純化，然后分別使用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳判斷純化產物的濃度與純度。文庫的制備和上機測序委托北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.4.4 序列分析

基于Miseq Illumina平臺的測序得到不同發酵時期沼液樣品文庫，對原始數據進行過濾處理，得到優化序列。使用QIIME[42]軟件中的UCLUST[43]對Tags在97%的相似度水平下進行聚類、獲得OTU，并基于Silva(細菌)和UNITE(真菌)分類學數據庫對OTU進行分類學注釋，用Mothur曲線可以分析所有樣品中細菌豐度[44]。Alpha多樣性可以用于分析單個樣本中微生物多樣性[45]。利用Shannon指數等方法完成多樣性分析指數分析，探索沼液發酵樣品中微生物

豐度與發酵時間的相關性[46-47]。

2 結果分析

2.1 堿液秸稈預處理效果比較

秸稈質量的變化和纖維素含量的變化可以直接反映整個預處理過程中秸稈結構的破壞及降解程度，預處理前后玉米秸稈主要成分變化見表1。預處理后固體的失重率在4.5%～28.2%之間，對照組的失重率最低，堿液處理的失重率最高。堿液處理對木質素、半纖維素有降解作用，可以很好去除木質素的包裹作用，提高纖維素含量，對提高沼氣產量有很好的促進作用。

表1 預處理前后玉米秸稈主要成分變化Table 1 Main contents variations of corn straw withpretreatment

2.2 不同微生物菌劑的產氣效果比較

沼氣發酵可以分析添加菌劑后的秸稈牛糞產沼氣潛力，整個厭氧消化周期為30 d，其沼氣日產率、累積產沼氣率、甲烷日產率及累積產甲烷率分別見圖1。

圖1 不同菌劑處理的沼氣和甲烷產量
Fig.1 Biogas and methane production from different microbial agents

沼氣日產率和甲烷日產率規律基本一致，均在2 d之內開始產沼氣和甲烷，并在整個產氣周期內出現4個產氣高峰。對照組的產氣率最低，添加菌劑1小組表現出較高的產沼氣及產甲烷率，最高沼氣產率和甲烷產率分別達到了72和39 mL/g VS。

由累積產氣及累積產甲烷率圖中可以看出，沼氣產率和甲烷產率均在前15 d快速上升，并達到最終產氣及產甲烷率的85%左右。添加菌劑1小組獲得最高的累積產沼氣及產甲烷率，最高累積產沼氣產率和甲烷產率分別達到了778和532 mL/g VS，而未添加菌劑的秸稈牛糞對照組的累積沼氣產率和累積甲烷產率分別為476、328 mL/g VS。添加微生物菌劑1，沼氣和甲烷產量提高效果最明顯，所以選擇產氣量最高的菌劑1處理進行發酵各個階段的高通量分析。

2.3 OTU 聚類分析

為了研究沼液的微生物組成，將3個不同時期采集的樣品分別記為A05、A06和A07，按照 97%相似性對非重復序列(不含單序列)進行OTU 聚類分析。

細菌OUT數量如圖2-a所示，其中A05組共得到941個OTU，A06組共得到1 093個OUT，A07組共得到1 137個OUT。分別將這3組兩兩比較發現，A05與A06共有的OTU為715個，A05與A07共有的OTU為707個，A06與A07共有的OTU 為865個。A05中特有的OTU為77個，A06中特有的OTU 為47個，A07中特有的OTU為80個。這3組的OTU 數一共為1 502個，它們共有的OTU 數為583個。

圖2 沼液樣品中細菌(a)和真菌(b) OTU數量的韋恩圖
Fig.2 Venn diagram of Bacteria (a) and fungal (b) OTU
number based on 16S rRNA gene sequence in biogas slurry

真菌OUT數量如圖2-b所示，其中A05組共得到819個OTU，A06組共得到830個OUT，A07組共得到866個OUT。分別將這3組兩兩比較發現，A05與A06共有的OTU為376個，A05與A07共有的OTU 為388個，A06與A07共有的OTU 為426個。A05中特有的OTU為286個，A06中特有的OTU 為241個，A07中特有的OTU為257個。這3組的OTU 數一共為1 620個，它們共有的OTU 數為257個。

結果顯示，在發酵初期真菌和細菌類群最少，隨著菌劑的加入和發酵的進行，微生物類群逐漸增多。不同發酵時期真菌特有的OUT數量要明顯大于細菌特有OUT數量，說明在不同發酵時期真菌微生物變化要大于細菌微生物變化。

2.4 微生物多樣性稀釋性曲線

使用Mothur軟件做稀疏性曲線分析，用于驗證測序數據量是否足以反映樣品中的物種多樣性，并間接反映樣品中物種的豐富程度。如圖3所示，發酵過程中細菌的豐度要大于真菌，微生物豐富程度為A07>A06>A05。真菌的OUT圖的平緩性更好，能很好反映樣本中絕大多數微生物多樣性信息，更好的展現了微生物的多樣性。

圖3 3個樣品細菌(a)和真菌(b)的稀釋曲線
Fig.3 Bacterium (a) and fungal (b) changes rarefaction
curve of three samples

2.5 微生物多樣性變化

表2 不同發酵階段微生物多樣性指數分析Table 2 Analysis of the bacterium and fungus diversityindex of the different stages

從表2結果來看，A07樣品細菌和真菌的Chao1豐富度指數最高，說明物種數量最多。A05樣品細菌Shannon指數值最大，Simpson指數值最小，說明該樣品細菌多樣性最豐富。A07樣品真菌Shannon 指數值最大，Simpson指數值最小，說明該樣品真菌多樣性最豐富。Coverage數值均大于0.98，表明該指數本次測序結果較好的反映了樣本中細菌和真菌的真實情況。

2.6 沼氣發酵過程微生物變化

2.6.1 沼氣發酵過程細菌門與屬的變化

在不同發酵時期采集發酵沼液進行高通量測序，不同的細菌類群變化差異見圖4-a。擬桿菌門的數量最為豐富，是最主要的優勢類群，在沼氣發酵過程中的相對豐度變化趨勢為增加，由發酵初期33.8%增加到發酵末期的43.6%；厚壁菌門是第二大優勢類群，與擬桿菌門的變化趨勢相反，厚壁菌門(Firmicutes)隨著沼氣發酵的進行，比例逐步減少，從發酵初期到發酵末期相對豐度由29.5%變為12.3%；第三大類群為變形菌門(Proteobacteria)，豐度變化為16.8～22.5%，發酵過程中相對豐度的變化趨勢是不斷增加。同時，在發酵過程中涉及其他原核生物類群，如互養菌門(Synergistetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、螺旋體門(Spirochaetae)、放線菌門(Actinobacteria)等。

不同的細菌類群屬變化差異見圖4-b。擬桿菌門中vadinBC27_wastewater-sludge_group含量最豐富，是最主要的優勢類群，在沼氣發酵過程中的相對豐度變化趨勢為增加，由發酵初期29.6%增加到發酵末期的35.9%，它是一種優勢產酸菌，該屬細菌不斷代謝發酵原料中殘留以及蛋白質水解產生的氨基酸，此菌屬還能夠代謝難降解有機物。互養菌門中的不能培養的Synergistaceae是第二大屬，該菌屬主要具有發酵氨基酸的功能，在去除沼氣發酵系統的中間代謝產物方面發揮重要作用，能發酵精氨酸、組氨酸和甘氨酸等氨基酸并產生甲酸、乙酸、丙酸、H2和NH3，也能降解吡啶二醇等難降解有機物，相對豐度由發酵初期12.3%降到到發酵末期的8.1%。變形菌門中的Pseudomonas是第三大屬，Pseudomonas是水解菌屬，可以降解原料中的纖維素成分，前期原料充足，Pseudomonas含量比較高，隨著發酵的進行，原料逐漸被利用，相對豐度由發酵初期9.8%降到到發酵末期的3.7%。

圖4 門(a)和屬(b)水平上前10名細菌的相對豐度
Fig.4 Relative abundance of the top bacteria at the
level of Phylum and Genus

2.6.2 沼氣發酵過程真菌門與屬變化

不同的真菌類群變化差異見圖5-a。子囊菌門(Ascomycota)的數量最為豐富，是最主要的優勢類群，在沼氣發酵過程中的相對豐度變化趨勢為先增加后降低，由發酵初期65.7%增加到發酵中期的84.7%，又降到發酵末期的66.8%；擔子菌門(Basidiomycota)是第二大優勢類群，與子囊菌門的變化趨勢相反，擔子菌門隨著沼氣發酵的進行，比例先減少后增多，從發酵初期到發酵末期相對豐度由5.3%變為3.1%。同時，在發酵過程中涉及其他真核生物類群，如鞭毛菌門(Mortierellomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、單孢菌門(Monoblepharomycota)等。

不同的真菌類群屬變化差異見圖5-b。子囊菌門中塊菌屬(Tuber)含量最豐富，是最主要的優勢類群，它是一種優勢產糖菌，該屬細菌產生的糖類物質可以為后續沼氣發酵提供原料，此菌屬豐度變化與沼氣產量相一致。在沼氣發酵過程中的相對豐度變化趨勢為先增加后降低，由發酵初期0.2%增加到發酵中期的51.7%，又降低到發酵末期的36.5%。子囊菌門中的枝氯霉屬(Ramichloridium)是第二大屬，該菌屬主要具有水解纖維素的功能，隨著發酵的進行，原料逐漸被利用，相對豐度不斷下降，由發酵初期11.6%降到到發酵末期的4.7%。

圖5 門(a)和屬(b)水平上前10名真菌的相對豐度
Fig.5 Relative abundance of the top fungus at the
level of Phylum and Genus

2.7 微生物多樣性聚類分析heatmap圖

從圖6可以看出，多樣性聚類分析A06和A07比較接近，而A05則與其他2個樣品差距較大，說明沼液發酵初期微生物的菌屬有很大變化，沼液發酵中后期微生物的菌屬變化不大。細菌前期主要是以假單胞菌、孢子菌主，發酵中期以擬桿菌為主，發酵后期為嗜角菌屬。真菌前期主要是以馬拉色菌、鏈格孢、短梗霉屬為主，發酵中后期以塊菌屬為主。

圖6 基于屬水平上的細菌(a)和真菌(b)聚類分析熱圖
Fig.6 Based on the genus level of Bacterial and
Fungus clustering analysis Heatmap

3 討論

在正常產氣的沼液中，存在著種群繁多的微生物，目前針對沼液中微生物分析主要采用傳統的微生物培養技術研究，但是微生物界約有99%的微生物是不能進行純培養的，會遺漏許多重要的沼液微生物學信息，因此無法來揭示沼液中微生物群落的全部生態信息。高通量測序技術作為一種無需微生物分離培養的快速檢測技術，能夠對樣品中的全部微生物進行種類和豐度鑒定，分析添加菌劑對發酵過程的影響，對于提高沼氣工程發酵效果，乃至開發新型沼氣工程菌劑都具有重要的意義。

如圖4和圖5可知，在細菌門中擬桿菌門與變形菌門之間呈顯著的正相關性，與厚壁菌門之間呈極顯著的負相關性。發酵過程中厚壁菌門豐度不斷減少，這與滑留帥等[37]研究結果一致，本試驗與其不同的是中擬桿菌門豐度一直處于增加狀態。在沼氣發酵系統中，可利用的有機質原料不斷減少，導致厚壁菌門的代謝活動減弱，相對豐度也相應減少。厚壁菌門的相對豐度變化趨勢與沼氣發酵系統的原料變化基本一致，表明這類群的代謝活動對沼氣發酵系統的產氣效率影響大。

微生物自制菌劑添加后，激活了細菌假單胞菌屬(Pseudomonas)和真菌中塊菌屬和枝氯霉屬的水解能力，大量纖維素被降解，為產乙酸菌提供了糖類物質，vadinBC27_wastewater-sludge_group和Synergistaceae大量生長，為產甲烷菌提供乙酸和甲酸等物質，增加了沼氣發酵系統沼氣的產量。

4 結論

本試驗研究了不同微生物菌劑添加對牛糞-玉米秸稈聯合沼氣發酵的影響，結果顯示微生物菌劑配比為蠟樣芽孢桿菌、熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌、松嫩假單胞菌(質量比3∶2∶3∶2)時產氣效果最好，在此條件下最高沼氣產率和甲烷產率分別達到了72、39 mL/g VS，最高累積產沼氣產率和甲烷產率分別達到了778、532 mL/g VS。

對添加最優微生物菌劑配比的沼氣發酵過程中的微生物多樣性進行高通量測序，測序結果表明，細菌中的擬桿菌門的數量最為豐富，是最主要的優勢類群，在沼氣發酵過程中的相對豐度變化趨勢為增加，由發酵初期33.8%增加到發酵末期的43.6%；真菌中子囊菌門的數量最為豐富，是最主要的優勢類群，在沼氣發酵過程中的相對豐度變化趨勢為先增加后降低，由發酵初期65.7%增加到發酵中期的84.7%，又降到發酵末期的66.8%。

高通測序結果顯示細菌擬桿菌門中vadinBC27_wastewater-sludge_group含量最豐富，是最主要的優勢類群，在沼氣發酵過程中的相對豐度變化趨勢為增加，由發酵初期29.6%增加到發酵末期的35.9%。互養菌門中的不能培養的Synergistaceae是第2大屬，該菌屬主要具有發酵氨基酸的功能，相對豐度由發酵初期12.3%降到到發酵末期的8.1%。變形菌門中的Pseudomonas是第3大屬，Pseudomonas是水解菌屬，相對豐度由發酵初期9.8%降到到發酵末期的3.7%。真菌子囊菌門中塊菌屬含量最豐富，是最主要的優勢類群，它是一種優勢產糖菌，在沼氣發酵過程中的相對豐度變化趨勢為先增加后降低，由發酵初期0.2%增加到發酵中期的51.7%，又降低到發酵末期的36.5%。子囊菌門中的枝氯霉屬是第2大屬，該菌屬主要具有水解纖維素的功能，隨著發酵的進行，原料逐漸被利用，相對豐度不斷下降，由發酵初期11.6%降到到發酵末期的4.7%。

本試驗通過研究牛糞-玉米秸稈聯合沼氣發酵的微生物群落結構變化，揭示高產沼氣發酵池的微生物群落結構特征，為牛糞-玉米秸稈聯合沼氣發酵菌劑制備提供理論依據。