黑曲霉酸性蛋白酶EXPA的克隆表達與酶學性質解析

王鑫，金鵬，宋鵬，董自星，劉曉光，王正祥,

1(工業發酵微生物教育部重點實驗室(天津科技大學)，天津，300457)2(天津科技大學 化工與材料學院，天津，300457)

蛋白酶是催化蛋白質水解的一類酶，是酶學研究中較早也是最深入的一種酶[1]。其產量占世界酶制劑產量的75%，而其年銷售額占全球酶制劑年銷售總額的65%左右[2]。根據最適作用pH的不同，可以將蛋白酶分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶。其中，酸性蛋白酶(即天冬氨酸蛋白酶，EC3.4.23.-)是指具有較低的最適反應pH(pH1.9～4.0)的蛋白酶。它們的活性中心含有2個天冬氨酸殘基，其特征是在低pH條件下可以將2個疏水氨基酸打斷，通過內切作用將動植物蛋白水解為小肽或氨基酸[3]。因此，酸性蛋白酶在食品、釀造、飼料、皮革、膠原纖維等工業制造領域具有廣泛的應用價值[4-5]。

酸性蛋白酶主要來源于動物的臟器和微生物。根據作用方式不同，微生物酸性蛋白酶可分為兩類：一類與胃蛋白酶相似，主要來源于青霉、曲霉和根霉；另一類與凝乳酶相似，主要產酶微生物是栗疫霉和毛霉等[5]。然而，商品化的酸性蛋白酶主要來源于黑曲霉、米曲霉和宇佐美曲霉等為數不多的菌株。此外，我國目前仍然沿用較傳統的固體發酵法生產酸性蛋白酶。與國際同類產品相比，無論是酶活水平還是產品質量都存在一定差距，限制了其工業應用范圍[6-7]。近年來，隨著分子克隆技術的快速發展，為催化性能優良的酸性蛋白酶的開發及其大規模生產提供了有效的途徑。

黑曲霉是酸性蛋白酶研究的重要研究對象之一。目前，黑曲霉中已報道的酸性蛋白酶有6個：PEPAa～PEPAd[8]、PEPA[9-10]和PEPE[11]，但只有PEPA的酶學性質被解析。為此，本研究擬將酸性蛋白酶基因pepAc(本研究中命名為expA)在畢赤酵母中進行克隆表達，并對其酶學性質進行系統解析，為其大規模生產及工業應用提供物質基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒及培養條件

黑曲霉(Aspergillusniger)CICIM F0510[12]以及大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109由本實驗室保藏；畢赤酵母表達宿主GS115和表達質粒pPIC9K購于Invitrogen公司。重組質粒pPIC-expA、重組畢赤酵母工程菌GS115 (pPIC-expA)由本研究中構建與保藏。黑曲霉和大腸桿菌分別采用PDA和LB培養基進行培養；畢赤酵母培養所用的培養基YPD、MD、BMGY和BMMY等按照Invitrogen公司的PichiaExpression Kit進行配制。

1.1.2 試劑

限制性內切酶、PyrobestDNA Polymerase以及T4 DNA連接酶等購自寶生物工程(大連)有限公司；質粒抽提試劑盒、PCR產物純化試劑盒與膠回收試劑盒等購于Axygen公司；RNA抽提試劑盒和cDNA合成試劑盒均由Roche公司提供；胰蛋白胨、酵母抽提物和無氨基酵母氮源等購自英國OXOID公司。G418以及BODIPY?FL NHS Ester (Succinimidyl Ester)等購于Thermo Fischer Scientific公司；EnzChek?Protease Assay Kit購自Molecular Probes公司；大豆分離蛋白和小麥水解蛋白購自上海源葉生物科技有限公司、陜西森弗天然制品有限公司；水溶性玉米蛋白和BCA蛋白質定量檢測試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組菌的構建

1.2.2 重組酶的分泌表達與初步純化

按照PichiaExpression Kit提供的方法進行操作?；緦嶒灢襟E如下：將畢赤酵母重組菌GS115(pPIC-expA)在YPD平板上進行純化，挑選單菌落接種到25 mL YPD液體培養基中，于30 ℃、200 r/min培養至對數生長期(OD600值為2.0～6.0，約18～20 h)。然后按1%(V/V)的接種量接種于50 mL BMGY液體培養基中，于30 ℃、200 r/min培養至對數生長期，離心(4 ℃，8 000 r/min)5 min收集菌體。再將菌體用50 mL BMMY培養基稀釋至OD600=1.0，于30 ℃、200 r/min繼續培養。每隔24 h補加無水甲醇至終濃度為0.5%(V/V)以維持誘導，并同時取樣測定酶活，直至酶活不再升高。發酵結束后，離心(4 ℃，8 000 r/min，10 min)收集發酵液，即為粗酶液。

采用鹽析、透析等方法對重組酶EXPA進行初步純化，并通過酶活測定和SDS-PAGE分析蛋白的純化情況。其中，SDS-PAGE參照文獻[14]進行，采用5%的濃縮膠和12%的分離膠。此外，蛋白濃度的測定采用BCA蛋白質定量檢測試劑盒進行。

1.2.3 重組酸性蛋白酶的酶學性質解析

1.2.3.1 酸性蛋白酶的酶活測定

采用EnzChek?Protease Assay Kit[15]進行酶活測定。基本步驟：將帶有熒光標記的酪蛋白溶于0.2 mL的磷酸鹽緩沖液中(pH 7.0)，充分混勻后，吸取50 μL的底物加入4.95 mL乳酸-酸鈉緩沖液(pH 3.0)。取該溶液0.1 mL于黑色96孔板中，再加入經適當稀釋的酶液0.1 mL，混勻，于40 ℃避光反應1 h。利用多功能酶標儀在λ(激發)∶λ(發射)=500 nm ∶530 nm下測定熒光強度。酶活定義：1 mL酶液在40 ℃、pH 3.0的條件下，1 h內水解帶有熒光標記的酪蛋白后熒光值的增加量，為1個酶活力單位(RFU/h)。

1.2.3.2 最適作用溫度和熱穩定性的測定

將適當稀釋的酶液分別在30、35、40、45、50、55和60 ℃下進行反應，并按照1.2.3.1的方法進行酶活測定。以酶活最高者為100%，計算相對酶活，從而確定該酶的最適作用溫度。

將適當稀釋的酶液分別放到40、45、50、55和60 ℃下保溫2 h，每隔30 min取樣，在冰上放置10 min后進行酶活測定(方法同1.2.3.1)。以未進行熱處理的酶液的酶活為100%，計算相對酶活，以確定重組酸性蛋白酶的熱穩定性。

1.2.3.3 最適作用pH值和pH穩定性的測定

用0.1 mol/L乳酸和0.2 mol/L乳酸鈉配制pH值分別為2.0、2.5、3.0、3.5和4.0的緩沖液，將酶液分別用這些緩沖液稀釋后進行反應，然后按照1.2.3.1的方法進行酶活測定。以酶活最高者為100%，計算相對酶活，從而確定重組酶的最適作用pH值。

分別將酶液在pH為2.0、2.5、3.0、3.5和4.0的乳酸-乳酸鈉緩沖液中保溫1 h(溫度為50 ℃)，并按照1.2.3.1的方法進行酶活測定。以未進行熱處理的酶活為100%計算殘余酶活力，從而確定酸性蛋白酶的pH穩定性。

1.2.3.4 金屬離子和相關化學試劑對酶活的影響

在酸性蛋白酶與其底物進行反應的體系中，加入不同的金屬離子或化合物，使其終濃度為1 mmol/L，然后按照1.2.3.1的方法進行酶活測定。以不加金屬離子的反應體系的酶活定義為100%，表示不同金屬離子或化合物下的相對酶活。

1.2.3.5 重組酶對不同蛋白質的水解作用

按照文獻的方法[16]，采用BODIPY? FL NHS Ester將大豆分離蛋白、小麥水解蛋白和水溶性玉米蛋白進行熒光標記，并將10 μg/mL標記后的蛋白作為重組酸性蛋白酶EXPA的底物，然后分別按照1.2.3.1的方法進行酶活測定。以10 μg/mL酪蛋白為底物時測定的酶活為100%，計算其他底物的相對酶活。

1.2.4 生物信息學分析

利用美國國立生物技術信息中心的網站(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查詢黑曲霉和其他來源酸性蛋白酶的氨基酸序列。然后利用在線軟件SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu. dk/services/SignalP/)對它們的信號肽進行預測。再采用軟件Clustal X2和Bioedit對氨基酸序列進行比對和分析，并通過軟件MEGA 5.0以Neighbour-joining法構建進化樹[17]，分析親緣關系遠近。

2 結果

2.1 黑曲霉酸性蛋白酶基因expA的克隆與分析

提取A.nigerCICIM F0510的總RNA，并反轉錄成cDNA。以此cDNA為模板，采用引物expA_1和expA_2對酸性蛋白酶基因expA(Gene ID: 4985680)進行PCR擴增。PCR產物經XbaI酶切后，與經過SnaB I和AvrII雙酶切的pPIC9K連接。再采用PstI酶切驗證重組質粒的正確性，獲得了重組質粒pPIC-expA。核苷酸序列測定的結果表明，所克隆的expA基因具有完整的開放閱讀框(ORF)，且其核苷酸序列與A.nigerCBS 513.88基因組公布的序列完全一致。其完整ORF大小為1 356 bp，編碼451個氨基酸殘基。

利用軟件MEGA 5.0對不同來源的酸性蛋白酶進行系統進化樹的構建，其結果如圖1所示。

圖1 進化樹描述不同來源的酸性蛋白酶的遺傳距離
Fig.1 Phylogenetic tree describing the genetic distances
among acid proteases from different microorganisms
線段的長度表示用MEGA 5.0計算的距離；分支節點上的數字代表bootstrap百分比，小于50%的bootstrap值未顯示；黑色的圓圈表示已報道的酸性蛋白酶；括號中標注的是GenBank登錄號；AoPEPA、RoPEP6、BcPEPA和AkPEPA分別來源于A.oryzae、RhizopusoryzaeNBRC 4749、Botrytiscinerea和A.kawachiiNBRC 4308，
其他酸性蛋白酶均來源于A.niger

由圖1可知，此進化樹反映了不同來源的酸性蛋白酶之間的遺傳距離，親緣關系近的遺傳距離短，而且聚集在一起。這些酸性蛋白酶之間的氨基酸序列相似度為19.36%～93.57%。其中，AnEXPA與AkPEPA的相似度最高，為93.57%。

進一步采用Clustal X2等軟件將上述不同來源酸性蛋白酶的氨基酸序列進行比對與分析，結果如圖2所示。除了AnPEPAb和AnPEPAd，其他酸性蛋白酶均含有信號肽。與其他酸性蛋白酶一樣，EXPA屬于天冬氨酸蛋白酶A1A家族，且具有天冬氨酸蛋白酶家族典型的活性位點基序：Asp-Thr-Gly (I)與Gly-H-H-Gly (II)形成第1個psi loop(其中，H為疏水性氨基酸)；Asp-Thr/Ser (III)與Ile-H-Gly-Asp/Gln/Asn (IV)形成第2個psi loop(圖2)[4]。它們還具有高度保守的酪氨酸殘基，這個Tyr殘基位于β發卡的loop中，懸于2個活性位點之上[18]。通過氨基酸序列比對可知，EXPA的活性中心為Asp115、Tyr223和Asp326。

2.2 重組酸性蛋白酶的分泌表達與分離純化

將重組質粒pPIC-expA用NcoI進行線性化后，電轉化入畢赤酵母GS115中，并通過G418平板篩選獲得高拷貝轉化子，命名為GS115 (pPIC-expA)。然后按照標準操作手冊對其進行搖瓶發酵實驗，發酵96 h后，重組酶的酶活為257380 RFU/h。進一步通過鹽析、透析等對EXPA的粗酶液進行了初步純化。蛋白電泳的結果(圖3)表明，EXPA的分子量大小約為46.0 kDa，與其理論分子量大小(45.9 kDa)一致；而且其純度也已基本達到酶學特征分析的要求。

2.3 重組酶EXPA的酶學性質解析

2.3.1 重組酶EXPA的最適作用溫度與熱穩定性

分別在不同溫度(30～65 ℃)下測定重組酶EXPA的酶活，結果如圖4-a所示。EXPA的最適作用溫度為50 ℃，且在50～55 ℃范圍內其相對酶活仍在80%以上。熱穩定性的研究(圖4-b)表明：在40和45 ℃孵育2 h后，EXPA的相對酶活殘留80%以上；在50和55 ℃孵育2 h后，重組酶的仍能分別保留45%和30%左右的相對酶活，具有較好的穩定性；而在60 ℃孵育2 h后，其殘留酶活只有10%。

2.3.2 最適反應pH和pH穩定性

分別將EXPA的酶液在不同pH值下(pH值2.0～4.0)進行反應，測定pH值對其酶活的影響，結果如圖5-a所示。EXPA的最適作用pH為3.0；pH<3.0或>3.0時，其相對酶活明顯下降。pH穩定性的研究結果(圖5-b)表明，重組酶EXPA在pH 2.5～3.5之間的穩定性較好，孵育1 h后，其相對酶活仍維持在80%左右。

(*)保守的氨基酸序列;(:)保守的替換;(.)半保守的替換;虛線表示空格;灰色部分標注信號肽;活性位點用方框標出;五角星標出的是保守的Tyr殘基圖2 不同來源酸性蛋白酶的氨基酸序列比對Fig.2 Multiple sequence alignment of acid proteases from different microorganisms

M-蛋白質分子量標準；1-粗酶液；2-純化后的EXPA圖3 SDS-PAGE分析重組酸性蛋白酶EXPA的純化情況Fig.3 SDS-PAGE analysis on the purification ofrecombinant acid protease EXPA

圖4 溫度對EXPA的活性(a)和穩定性(b)的影響
Fig.4 Effects of temperature on the activity (a)
stability (b) of EXPA

圖5 pH對重組酸性蛋白酶EXPA的酶活(a)和
穩定性(b)的影響
Fig.5 Effects of pH on the activity (a) and stability (b)
of recombinant acid protease EXPA

2.3.3 金屬離子和化學物質對EXPA酶活的影響

在酶促反應體系中加入1 mmol/L不同的金屬離子或化合物，研究其對EXPA酶活的影響，結果見表1。Zn2+、Ca2+、Fe2+和Mn2+對其活性均有輕微的促進作用，Cu2+、Co2+、Fe3+、EDTA以及SDS等會明顯抑制EXPA的活性，而K+則對該重組酶的酶活沒有明顯影響。

2.3.4 重組酶EXPA對不同底物的水解能力

將不同來源的植物蛋白用BODIPY?FL進行熒光標記后，作為重組酸性蛋白酶EXPA的底物，研究它對這些蛋白質的水解作用。以EXPA對帶有熒光標記酪蛋白的酶活為100%，計算相對酶活，結果如表2所示。EXPA對它們的水解能力大小如下：酪蛋白>大豆分離蛋白>水溶性玉米蛋白>小麥水解蛋白。

表1 金屬離子及化合物對重組酶EXPA活性的影響Table 1 Effects of metal ions and chemicals on theactivity of recombinant acid protease EXPA

表2 重組酸性蛋白酶EXPA對不同蛋白質的水解作用Table 2 Hydrolysis of different proteins by recombinantacid protease EXPA

3 討論

酸性蛋白酶是一類具有復雜理化性質的酶，不同微生物分泌的酸性蛋白酶雖具有一些共同的性質，但在最適反應溫度、熱穩定性、最適反應pH以及pH耐受性方面均存在一定的差異。不同的金屬離子及其濃度對酸性蛋白酶的影響也不同。目前，用于工業化生產的酸性蛋白酶大多為霉菌酸性蛋白酶，此類酶不耐熱，當溫度達到50 ℃以上時很不穩定，且其最適作用pH值為3.0左右，當pH值升高時，其酶活會明顯降低，從而限制了酸性蛋白酶的應用[5]。本研究通過分子克隆技術成功將黑曲霉CICIM F0510的酸性蛋白酶基因在畢赤酵母中進行了分泌表達，所獲得的重組酶EXPA的最適作用溫度以及pH值分別為50 ℃和3.0；在55 ℃孵育2 h后，其殘留酶活仍有30%左右，而且在pH值3.5(50 ℃)孵育1 h，它仍能保持80%左右的相對酶活(圖4和圖5)。與AnPEPA[10]、RoPEP6[19]、AoPEPA1[20]等大多數霉菌酸性蛋白酶相比，EXPA具有較好的pH和熱穩定性，這拓寬了其應用范圍。此外，Ca2+和Mn2+是重組酶EXPA的激活劑，而Cu2+、Fe3+則對其酶活具有抑制作用，這與它們對酸性蛋白酶SAP6[21]和rPrA[22]酶活的影響一致。

由于飼用酶的催化反應是在畜禽消化道內進行的，故其作用條件必須與動物消化道的生理條件相適應。通常豬和家禽消化道的溫度為40 ℃左右，胃和小腸的pH值分別為1.5～3.5和5.0～7.0[23]。這與重組酸性蛋白酶EXPA的理化性質相吻合。此外，EXPA還對大豆分離蛋白、水溶性玉米蛋白和小麥水解蛋白等具有較好的水解作用(表2)，所以該重組酶在動物飼料方面可能具有潛在的應用價值。后續將進一步通過體外法甚至動物實驗對該重組酶水解蛋白飼料的效果進行評價，挖掘其可能的應用價值。

本研究雖然成功將酸性蛋白酶EXPA在畢赤酵母中進行了克隆表達，但其表達量仍不是很高，采用國標(GB/T 23527-2009)法測得其酶活為8.76 U/mL(比酶活為17.81 U/mg，數據未顯示)，遠低于AnPEPA和AoPEPA1的酶活(分別為370 U/mL[10]、43.1 U/mg[20])。后續將通過發酵條件優化等方法，進一步提高EXPA的表達量，以期實現其大規模生產，并為其應用奠定良好的基礎。

綜上所述，本文通過分子克隆與遺傳重組技術成功將黑曲霉酸性蛋白酶基因expA在畢赤酵母中進行了分泌表達與酶學特性研究。重組酶良好的理化性質及其對大豆分離蛋白、玉米水溶蛋白和小麥水解蛋白的水解作用，為其在飼料等行業的應用提供了可能。