超聲制漿對復水冷凍干燥豆腐水分分布及微觀結構的影響

李楊，劉寶華，馬春芳，牛祥臣，王中江，江連洲，劉軍*

1(東北農業大學 食品學院，黑龍江 哈爾濱，150030) 2(山東禹王生態食業有限公司，山東 禹城，251299)

葡萄糖酸-δ-內酯(gluconic acid zlactone，GDL)豆腐是以GDL為促凝劑制作的豆腐，由于其中含有大量水分和蛋白質，極易腐敗變質。將其冷凍制成凍豆腐后，復水后卻沒有傳統豆腐的細膩感，并有海綿體形成，影響了口感[1]。且凍豆腐經常需要在冷鏈內儲藏或運輸。將豆腐制備成冷凍干燥豆腐后，不僅可滿足其運輸上的需求，還可以降低儲存難度。

近年來，由于超聲處理可對大豆蛋白改性并且無外源性化學物質生成，對環境不造成污染而引起人們的廣泛關注。HU等[2]研究發現，高場強超聲處理可提高β-伴大豆球蛋白的表面疏水性、溶解性，乳化活性及乳化穩定性。O’SULLIVAN等[3]研究發現，與未經超聲處理的乳液相比，經超聲處理得到的大豆蛋白乳液的粒徑更小。HU等[4]研究發現，高場強超聲波可以降低大豆分離蛋白溶液的粒徑，提高葡萄糖酸內酯誘導大豆分離蛋白凝膠的凝膠性。LIN等[5]采用超聲波處理豆漿替代傳統工藝中的煮漿和冷卻過程，結果發現超聲波處理可提高GDL豆腐的硬度。ZHANG等[6]研究發現，高場強超聲可增強分子間ε-(γ-谷酰基) 賴氨酸異肽鍵、二硫鍵和疏水相互作用，從而使谷氨酰胺轉移酶大豆蛋白冷凝膠的微觀結構均勻、致密，并提高其凝膠強度、硬度和持水性。齊寶坤等[7]研究發現，適宜的超聲處理可降低豆乳體系的粒徑，提高豆腐的持水性，改善冷凍干燥豆腐的微觀結構并提高其復水性。HARNKARNSUJARIT等[8]采用液氮處理制備出了具有較好微觀結構及復水效果的冷凍干燥豆腐。

低場核磁共振(low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)是一種無損、非侵入性測量高含水量樣品水分分布狀態及移動性的工具[9]。LF-NMR在肉類及植物中的運用較多，但近年來已有研究者將其運用于豆腐水分分布的分析中，如LI等[10-11]利用LF-NMR分別研究了凝固劑種類對豆腐水分分布影響以及高壓均質處理對南北豆腐水分分布的影響。朱巧梅等[12]研究了新型油包水鹽鹵凝固劑對大豆蛋白凝膠中水分變化的影響。LI等[13]采用LF-NMR研究了冷凍時間對豆腐水分分布的影響。但超聲制漿工藝對鮮豆腐以及復水冷凍干燥豆腐的水分分布鮮有人進行研究。

鑒于此，本文通過對豆漿進行超聲處理(0、100、200、300、400，500 W，10 min)并制備成GDL填充豆腐，聯合短時液氮處理和真空冷凍干燥技術制備冷凍干燥豆腐，利用LF-NMR及掃描電子顯微鏡研究超聲制漿工藝對復水冷凍干燥豆腐水分分布及微觀結構的影響，以期為將超聲制漿工藝運用于冷凍干燥豆腐生產中提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆(蛋白質含量42.8%，脂肪含量18.2%)，購自，當地超市；消泡劑，鄭州大志食品有限公司；葡萄糖酸-δ-內酯，江西新黃海醫藥食品化工有限公司；液氮，購自當地液氮公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

JJ-2型組織搗碎勻漿機江，蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；JY92-IIN超聲波細胞粉碎機，寧波新藝超聲設備有限公司；DK-S12數顯恒溫水浴鍋，上海三發科學儀器有限公司；FD-5型真空冷凍干燥機，北京博醫康技術公司；SU8020冷場掃描電子顯微鏡，日本日立公司；Mq-20低場核磁共振分析儀，德國布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲處理豆漿

將新鮮大豆清洗干凈，以1∶5(g∶mL)的比例浸泡于蒸餾水中15 h，將浸泡好的大豆以1∶5(g∶mL)的豆水比磨漿，用棉布過濾2次后加入0.1 g/L的消泡劑消除泡沫。由于豆漿的煮漿時間為10 min，因此本試驗以不同超聲功率對豆漿進行10 min超聲處理。分別取適量的豆漿于超聲波細胞破碎儀中，液面浸沒變幅桿3 cm，分別在超聲功率0、100、200、300、400，500 W條件下超聲10 min，工作時間和間歇時間均為4 s，以冰水浴控制超聲溫度為(20±2)℃。

1.3.2 冷凍干燥豆腐的制作工藝

HARNKARNSUJARIT等[8]的方法制備冷凍干燥豆腐，略作修改。

將處理后的豆漿煮沸10 min，冷卻至80℃時加入3.0 g/L的GDL，充分混勻后置于80℃恒溫水浴鍋中保溫30 min得到豆腐花，隨后壓制成GDL豆腐(壓力為0.01 kg/cm2)。將GDL豆腐切成10 mm×10 mm×9 mm的豆腐塊，置于-196 ℃液氮中保存15 min后轉移至-40 ℃冰箱冷凍24 h制成冷凍豆腐。隨后利用真空冷凍干燥機處理得到冷凍干燥豆腐。

1.3.3 冷凍干燥豆腐復水處理

復水處理參考HARNKARNSUJARIT等[8]的方法。將冷凍干燥豆腐置于25 ℃蒸餾水中浸泡100 min后取出，用濾紙擦干表面水漬用于后續實驗。

1.3.4 析水率的測定

豆腐持水性的測定參考AND等[14]和HARNKARNSUJARIT等[8]方法。取質量約3 g剛制備好的鮮豆腐或復水豆腐樣品于離心管中，在3 000 r/min的條件下離心30 min，離心結束后吸干其表面水分后，按公式(1)計算樣品的析水率：

(1)

式中：m1，離心前樣品的質量，g；m2，離心后樣品的質量，g。

1.3.5 低場核磁共振

根據LI等[10]的方法利用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)脈沖序列測定鮮豆腐及復水豆腐的橫向弛豫時間(T2)。將約3 g樣品放入核磁管中，隨后放入分析儀中檢測。CPMG序列采用的參數：質子共振頻率為22.6 MHz，回波個數C0=3 000，重復掃描次數NS=16，半回波時間TE=0.15 ms。利用CONTIN軟件調用CPMG序列反演，記錄每個峰時間常數T2i(峰頂時間)及其所占面積分數M2i用于后續分析。

1.3.6 掃描電鏡的測定

將復水冷凍干燥豆腐(下文簡稱復水豆腐)及鮮豆腐采用2.5%(體積分數)的戊二醛進行固定，固定時間為24 h。隨后經乙醇梯度洗脫、叔丁醇置換，冷凍干燥處理后，采用離子濺射方法鍍金，鍍金的條件為15 kV，15 mA，1.5 min。然后將樣品置于掃描電子顯微鏡(10 kV，100 Pa)下觀察其顯微結構，鮮豆腐圖像10 000倍放大，復水豆腐圖像1 000倍放大。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 超聲制漿工藝對鮮豆腐及復水豆腐持水性的影響

凝膠的析水率可反映其持水性的強弱，析水率越低，則凝膠的持水性越強。由圖1可知，當超聲功率為0～300 W時，2種豆腐的析水率隨超聲功率的增強而逐漸降低，這可能是由于適宜的超聲處理可提高豆漿體系內蛋白的溶解性，降低蛋白和脂肪等物質的粒度，使其形成更加均一的空間結構，而這種空間結構可能會有益于凝膠對水分子的綁定[15]。前期實驗結果[7]表明，豆漿的平均粒徑隨超聲功率的增強而呈先降低后增大的趨勢，當超聲功率為300 W時，豆漿的平均粒徑最小。WU等[16]研究發現提高蛋白質的溶解性、降低其平均粒徑可增強凝膠的持水性。KAO等[17]研究發現，較小的孔隙可以更牢固地保留水分子。當超聲功率大于300 W時，2種豆腐的析水率逐漸增大，這可能是由于過高的超聲功率致使豆漿體系內部分蛋白發生聚集，形成大的蛋白質聚合物，使豆腐內部存在較大的空隙，從而使水分更易從豆腐內部析出。HU等[4]研究發現，大豆蛋白粒徑較大時會導致凝膠網絡結構內形成大的孔洞，進而促進水分子的釋放，降低凝膠持水性。由圖1可知，復水豆腐的析水率顯著高于鮮豆腐(P<0.05)，這可能是由于鮮豆腐在預冷凍過程中，水分迅速凍結形成冰晶，體積變大膨脹，經冷凍干燥處理后，冰晶升華后留下大小不一的孔洞，改變了豆腐的微觀結構，進而使復水豆腐孔洞的尺寸變大(如圖5和圖6)，從而降低了對水分子的保留率。

圖1 超聲制漿工藝對鮮豆腐及復水冷凍干燥豆腐
析水率的影響
Fig.1 Effects of ultrasound pulping process on the water
separating proportion of fresh tofu and rehydrated
freeze-dried tofu

2.2 超聲制漿工藝對鮮豆腐及復水豆腐水分分布的影響

由于LF-NMR可測量對分子運動敏感的T2弛豫時間，因此可采用LF-NMR估量凝膠體系中被蛋白質局部固定的不同水分子組分的流動性和結構特性[18-19]。圖2-a、圖2-b分別為超聲制漿工藝對鮮豆腐和復水豆腐T2弛豫時間分布的影響，其LF-NMR衰減曲線擬合的T2`弛豫時間均分布為3個峰，分別對應為結合水(T2b，1.11～3.02 ms)、不易流動水(T21，13.35～217 ms)和自由水(T22，132.08～709.1 ms)[20]。LI等[11]研究發現，豆腐中油脂對水分弛豫信號的影響可以忽略，因此本部分討論不考慮豆腐中油脂存在的影響，并根據研究結果對鮮、復水豆腐中3種水分作如下歸類：T22組分為遠離蛋白質結構的水，這部分水存在于豆腐基質中較大孔徑的孔洞之中，受蛋白質結構影響較小；T21組分受蛋白質結構影響較大，這部分水存在于豆腐基質中一些較小的孔洞中；T2b組分則被認為是一些和蛋白質高分子緊密結合的水分，甚至可被認為是蛋白質的一部分。

a-鮮豆腐；b-復水冷凍干燥豆腐;1-0 W;2-100 W;3-200 W;4-300 W;5-400 W;6-500 W圖2 超聲制漿工藝對鮮豆腐及復水冷凍干燥豆腐T2弛豫時間的影響Fig.2 Effects of ultrasound pulping process on the T2relaxation time of fresh tofu and rehydratedfreeze-dried tofu

豆腐的三維網絡結構是由大小不一的孔洞和網孔組成，當豆腐經過冷凍處理后，這些孔洞和網孔形成更不均勻的微環境。此外，冰晶的形成和大豆蛋白的冷凍變性也促進了水中更復雜和多樣的松弛行為[13]。對比圖3、圖4中數據可知，與鮮豆腐相比，復水豆腐的T21顯著增大，這可能是由于鮮豆腐在冷凍過程中會形成大量的冰晶，而這些冰晶在升華后會形成大小不一的孔洞，從而使復水豆腐內部孔洞的孔徑變大，結構變得疏松。YASUI等[19]研究發現，弛豫時間越長，水分子組分與大分子的結合越松散。與鮮豆腐相比，復水豆腐的M21顯著降低(P<0.05)，M22顯著增高(P<0.05)，這說明冷凍干燥豆腐經復水處理后，有更多的自由水進入到豆腐內部的網絡結構中。

由圖3、圖4可知，當超聲功率為0～300 W時，鮮豆腐和復水豆腐的T21弛豫時間和M21峰面積百分數均分別隨超聲功率的增大而顯著降低和升高(P<0.05)，這可能是由于隨著超聲功率的增大，蛋白-蛋白之間的交聯作用增強，蛋白質網絡結構中的孔隙逐漸變小(如圖5、圖6)，進而將部分不易流動水(T21)包埋在這種微觀結構中，從而使T21降低[12]。李騰[21]通過研究高壓均質處理對南北豆腐水分分布的影響發現，致密的網絡結構可縮短蛋白質網絡表面與水分子的距離，從而使T21降低。此外，兩種豆腐的M22均隨超聲功率的增大而顯著降低(P<0.05)，這可能是由于超聲處理可促使豆腐中的自由水向不易流動水轉化[22]。還有可能是隨著超聲功率的增大，豆漿內蛋白質逐漸解聚，顆粒變小，疏水性基團暴露并促進二硫鍵的形成或交換，使得豆腐的網狀結構逐漸變得致密，提供了更多可用于截流自由水組分的結構[23]。當超聲功率大于300 W時，兩種豆腐的T21、M21和M22均分別隨超聲功率的增大而呈顯著增高、降低和增高(P<0.05)，這可能是由于隨著超聲功率繼續增強，豆腐內部形成較大的孔洞，從而使更多的自由水進入到網狀結構內部[12]。而兩種豆腐的M22均隨超聲功率的增大而顯著升高(P<0.05)，這可能是由于超聲功率過高致使豆腐微觀結構逐漸變得疏松，孔徑變大(如圖5和圖6)，從而使得自由水組分含量升高。李騰[21]通過研究豆腐T2弛豫參數與其持水性之間的皮爾森相關分析，發現T21與凝膠的持水性呈顯著正相關。以上結果進一步證明，適宜的超聲處理可顯著改善豆腐的持水性。

圖3 超聲制漿工藝對豆腐T2弛豫時間的影響
Fig.3 Effect of ultrasound pulping process onT2
relaxation time of tofu

圖4 超聲制漿工藝對豆腐各弛豫峰峰面積百分數的
影響
Fig.4 Effect of ultrasound pulping process on fraction of
each relaxation component of tofu

2.3 超聲制漿工藝對鮮豆腐及復水豆腐微觀結構的影響

對比圖5和圖6可知，復水豆腐的孔洞尺寸顯著大于鮮豆腐，這可能是由于鮮豆腐在冷凍過程中涉及了水分由液體至固體的轉變，而水結冰時其體積會膨脹變大，形成冰晶并對豆腐的微觀結構產生不可逆的機械破壞[24]，從而使復水豆腐微觀結構中孔洞的孔徑變大[25]。而液氮的迅速冷凍效應使鮮豆腐在凍結過程中形成的冰晶體分布更接近于其原有體系中的水分分布情況，冰晶體小而密集[26]，從而可使復水豆腐極大程度上保持鮮豆腐原有的色澤、口感及特性。

A-F依次為超聲功率0～500 W，鮮豆腐圖像的放大倍數為10 000倍圖5 超聲制漿工藝對鮮豆腐微觀結構的影響Fig.5 Effects of ultrasound pulping process on themicrostructure of the fresh tofu

A-F依次為超聲功率0～500 W,復水冷凍干燥豆腐圖像的放大倍數為1 000倍圖6 超聲制漿工藝對復水冷凍干燥豆腐微觀結構的影響Fig.6 Effects of ultrasound pulping process on the micros-tructure of the rehydrated freeze-dried tofu

由圖5和圖6可知，當超聲功率為0～300 W時，鮮豆腐及復水豆腐內部孔洞的孔徑均隨超聲功率的增大而逐漸減小，結構逐漸變得均一、致密。這可能是由于超聲處理使豆乳內蛋白質發生變性，隨后的加熱處理進一步促進了蛋白質四級結構解離[27]，疏水基團暴露[5]，提高了蛋白質分子間的疏水相互作用。HU等[28]研究發現超聲處理豆乳中蛋白質聚集體表面疏水基團的數量從根本上決定了豆腐的結構。而RENKEMA等[29]研究發現蛋白質分子的大小和形狀可影響凝膠的微觀結構。因此超聲處理可通過降低豆乳體系的粒徑來促使豆腐形成均一、致密的結構。當超聲功率大于300 W時，靜電引力和疏水區域的二硫鍵促使變性蛋白質發生聚集，形成大的蛋白質聚集體，降低蛋白質溶解度[28]，提高豆漿體系的平均粒徑，從而使鮮豆腐及復水豆腐孔洞的孔徑逐漸增大。

3 結論

通過研究不同超聲功率(0、100、200、300、400，500 W)對鮮豆腐及復水冷凍干燥豆腐持水性、水分分布及微觀結構的影響，得到如下結果：

(1)復水豆腐的析水率顯著高于鮮豆腐(P<0.05)，這可能是由于鮮豆腐在預冷凍過程中，水分迅速凍結形成冰晶，體積變大膨脹，改變了豆腐的微觀結構，進而使復水豆腐孔洞的尺寸變大，從而降低了對水分子的保留率。

(2)當超聲功率為0～300 W時，超聲功率的逐漸增強促進了疏水性基團的暴露，豆漿內蛋白質間相互作用增強，兩種豆腐微觀結構孔洞的孔徑逐漸變小，持水性逐漸增強，T21弛豫時間逐漸縮短，M21逐漸增大。

(3)當超聲功率大于300 W時，過高的超聲功率促使變性蛋白質發生聚集，形成大的蛋白質聚集體，降低蛋白質溶解度，粒徑增大，從而使兩種豆腐微觀結構孔洞的孔徑逐漸增大，持水性下降，T21弛豫時間逐漸延長，M21逐漸降低，M22逐漸增大，自由水組分含量逐漸增高。

(4)適宜的超聲處理(超聲功率為300 W)可改善復水冷凍干燥豆腐的微觀結構，降低其孔徑的尺寸大小，使其結構變得均一、致密。

本實驗具體分析了超聲制漿工藝對鮮、復水豆腐水分分布及微觀結構的影響規律，實驗結果將為生產具有良好復水特性的冷凍干燥食品提供理論基礎。