Streptococcus thermophilus S10復合Lactobacillus plantarum P-8在發酵豆乳中的應用

郭帥，韓之皓，黃天，鄭巖，王月嬌，白梅，王記成，孫天松，張和平*

1 (乳品生物技術與工程教育部重點實驗室(內蒙古農業大學)，內蒙古 呼和浩特，010018)2 (農業農村部奶制品加工重點實驗室(內蒙古農業大學)，內蒙古 呼和浩特，010018)

大豆中含有豐富的蛋白質、多不飽和脂肪酸、膳食纖維、礦物質和維生素[1]，在《中國居民膳食指南(2016版)》中建議經常食用大豆制品[2]。發酵豆乳是豆制品的重要組成部分，是在豆漿基礎上接種乳酸菌發酵而成的植物性發酵食品。經乳酸菌發酵作用，發酵豆乳可提高脂質代謝，不會引起肥胖[3]；發酵后的大豆蛋白質更容易消化吸收，且能提高機體免疫力并有效降低血清中總膽固醇含量[4]；被分解的大豆低聚糖能促進益生菌增殖，保持腸道健康[5]；此外，還可有效降解大豆中的抗營養因子和消除豆腥味[6]。本研究菌種StreptococcusthermophilusS10(S.thermophilusS10)是在乳品生物技術與工程教育部重點實驗室乳酸菌菌種資源庫的406株S.thermophilus中篩選得到的1株具有良好發酵大豆乳特性和弱化后酸能力較好的S.thermophilus[7]。LactobacillusplantarumP-8(L.plantarumP-8)是本實驗室于2005年分離自內蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗草原上牧民家庭自然發酵酸牛乳樣品中的1株具有優良益生特性的L.plantarum，在消化系統中具有優異的耐受胃酸、腸液和膽鹽能力[8-9]，在單菌發酵大豆乳實驗中證明可顯著提高其活性大豆異黃酮含量[10]。本研究應用S10+P-8發酵豆乳，為開發一款符合現代生活要求的新型產品提供理論研究基礎和一定的技術參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種及培養基

本研究所用S.thermophilusS10和L.plantarumP-8直投式發酵劑由乳品生物技術與工程教育部重點實驗室乳酸菌菌種資源庫提供，商業發酵劑A和B分別購自科漢森(中國)有限公司、丹尼斯克(中國)有限公司；所用培養基為合成MRS-V(萬古霉素 10 mg/L)固體培養基和合成ST固體培養基。

1.1.2 主要實驗材料

全脂大豆粉，蛋白質含量≥39%，黑龍江農墾龍王食品有限公司。

1.1.3 主要儀器與設備

NSC-II A-1200型無菌工作臺；雷磁PHS-3C 型pH計，上海精密科學儀器有限公司；TA-XT plus型質構儀，英國SMS公司；SRH 60-70型高壓均質機，上海申鹿均質機有限公司；Brookfield DV-1型黏度計，上海君翼儀器設備有限公司；SA 402B型味覺感應系統，日本Insent公司；Waters Acquity UPLC-QTOF MS超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜儀，沃特世科技(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵豆乳樣品制備

將全脂豆粉(6.6%)與蔗糖(8%)混合后加入到60 ℃蒸餾水(85.4%)攪拌均勻，然后于65℃、30 MPa條件下均質，95℃殺菌5 min，冷卻至(42±0.5)℃接種發酵劑[6]。樣品置于42 ℃恒溫發酵至pH接近4.50后，轉至4℃過夜后熟，4℃貯藏28 d。發酵過程中每隔2 h取樣檢測，貯藏期間每隔7 d取樣檢測；接種量依據商業發酵劑產品說明0.03 g‰添加，實驗組按照S.thermophilusS10∶L.plantarumP8=1 000∶1添加，其中S.thermophilusS10添加量為2×106CFU/mL。

1.2.2 實驗組樣品活菌數測定

實驗組S.thermophilusS10采用ST固體培養基進行選擇培養[11]；L.plantarumP8采用固體培養基MRS-V(萬古霉素10 mg/L)進行選擇培養[12]。37 ℃恒溫厭氧培養(72±6)h，記錄菌落數變化。

1.2.3 發酵豆乳樣品酸度測定

pH值測定：采用雷磁PHS-3C 型pH計直接測定；

滴定酸度測定：發酵豆乳的滴定酸度按照國家標準GB5009. 239 — 2016中規定的“酚酞指示劑法”進行檢測[13]。

1.2.4 發酵豆乳樣品黏度、持水性測定

黏度測定：發酵豆乳樣品放至室溫后，采用Brookfield DV-1型黏度儀4#轉子進行測定，轉子轉速為100 r/min，扭矩為10%～100%，測定時間為30 s。

持水性測定：準確稱取發酵豆乳樣品20.00 g，置于有濾紙的漏斗中，室溫放置90 min后收集濾液并稱重[14]。計算方法如下：

(1)

1.2.5 發酵豆乳樣品游離大豆異黃酮含量測定

樣品處理：取4 mL發酵豆乳上清液于10 mL EP管中，加4 mL乙醇，加HCl至濃度為1 mol/L，混勻，80℃孵育60 min，9000×g高速離心10 min，取1 mL上清液經0.22 μm膜過濾于樣品瓶中備用，色譜條件按照米智慧等[15]進行設定。

1.2.6 發酵豆乳樣品質構特性測定[16]

將樣品溫度恢復至室溫，應用質構分析儀測定其質構特性，檢測指標有堅實度、稠度、黏性、黏滯指數。TPA測定參數如下：測定前探頭速度、測定時探頭速度、測定后探頭速度均為1.00 mm/s；測定距離20 mm；探頭柱型AEC，盤徑35 mm；感應力Auto-5 g；數據攫取速度200 pps。

1.2.7 發酵豆乳樣品基本味覺特征評價

將后熟完成且恢復常溫的樣品3 000×g離心10 min后過濾上清液，所得濾液于4℃、8 000×g離心10 min，除去上層油脂后留濾液備用[17]。樣品測定具體操作以KOBAYASHI Y等[18]進行樣品的測定。

1.2.8 發酵豆乳樣品感官品鑒

貯藏期間，發酵豆乳樣品每7 d進行1次感官品鑒。感官品鑒小組由5名女性、5名男性共10名品鑒人員組成，10名品鑒人員經常飲用發酵乳(豆乳和牛乳)，并接受2次時間為2 h的感官鑒評培訓[19]。評鑒指標有表觀指標、氣味指標、風味指標和質地指標，評分采用100分制[20]。

1.2.9 數據分析

實驗至少重復3次，各指標均為3組平行，結果表示為(X±s。采用SPSS 21.0軟件對實驗數據進行統計學分析，2組數據間的比較采用獨立樣本T檢驗(independent-samples T-test)進行分析，顯著性水平設定為0.05；3組或多于3組數據間的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)的Duncan’s法進行兩兩比較分析，顯著性水平同樣設定為0.05。作圖采用Origin lab 2017軟件。

2 結果與分析

2.1 實驗組樣品在貯藏期間活菌數變化情況

本實驗研究內容為活菌型益生菌發酵豆乳，歐盟規定在貨架期內益生菌產品益生菌活菌數須保持在106CFU/mL以上[21]。將4 ℃貯藏的樣品進行發酵完成、后熟、7、14、21和28 d活菌數統計，作為衡量本樣品貯藏穩定性的重要評定標準。

表1 實驗組樣品在貯藏期間活菌數變化情況Table 1 Changes of viable bacterial counts of fermentedsoymilk experimental group with storage time

注：不同小寫字母代表差異顯著性，P<0.05。

由表1可知：貯藏期間，S.thermophilusS10活菌數在14 d后有下降趨勢(P<0.05)；益生菌L.plantarumP-8活菌數在21 d時有下降趨勢(P<0.05)；貯藏結束時，S.thermophilusS10維持在4.00×107CFU/mL以上；益生菌L.plantarumP-8的活菌數維持在1.0×109CFU/mL以上。本實驗證明應用S10+P-8發酵豆乳，益生菌L.plantarumP-8具有很好的貯藏穩定性。

2.2 發酵豆乳在發酵、貯藏期間酸度變化情況

由圖1可知：添加不同發酵劑分別發酵豆乳，發酵期間酸度均有顯著變化(P<0.05)。發酵過程中，添加發酵劑A的樣品在0～4 h期間pH值、滴定酸度變化顯著(P<0.05)；添加S10+P-8、發酵劑B的樣品在2～6 h期間pH值、滴定酸度變化顯著(P<0.05)；3種樣品到達發酵終點所需時間約9 h，pH分別是4.48、4.48和4.47，滴定酸度分別是60.64、58.40和58.21 °T，差異不顯著。在貯藏期間，3種發酵豆乳樣品酸度有顯著變化(P<0.05)。貯藏結束時pH在4.30左右，組間差異不顯著，滴定酸度在74.00 °T以下，S10+P-8組與發酵劑A組之間差異不顯著，分別是68.78 °T和68.51 °T，低于發酵劑B組，差異顯著(P<0.05)。發酵豆乳在貯藏期間酸度保持是體現高品質的重要標準，一般商業發酵乳的pH值4.2～4.4[22]。

圖1 發酵過程及貯藏期間3種發酵豆乳樣品
酸度變化情況
Fig.1 The acidity of three groups of fermented soymilk
samples during fermentation and storage period

2.3 發酵豆乳在發酵、貯藏期間黏度變化情況

添加不同發酵劑分別發酵豆乳，發酵過程和貯藏期間黏度測定結果如圖2所示：發酵過程中各組樣品黏度均顯著升高(P<0.05)，發酵劑A組樣品約4 h達到凝乳狀態，與S10+P-8組和發酵劑B組樣品有顯著差異(P<0.05)；S10+P-8組和發酵劑B組樣品約6 h凝乳。發酵結束時，樣品組間黏度無顯著差異。有研究者認為黏度無顯著差異可能是由于菌體增殖產生乳酸，導致發酵豆乳中乳酸的含量增加到足夠濃度時，大豆蛋白凝固形成酸凝膠使黏度迅速增加，使菌體代謝受到抑制，乳酸的生成速度下降，限制了黏度繼續上升，致使最終黏度保持相對穩定狀態[23]。3組樣品經4 ℃過夜后熟黏度顯著升高，其中S10+P-8組黏度較高，差異顯著(P<0.05)。這是由于完成發酵后乳酸菌依舊保持較高活力活性，胞外多糖繼續積累，相比之前黏度變化顯著(P<0.05)。在4 ℃、28 d貯藏期間，組內黏度變化差異不顯著，其中S10+P-8組黏度較高，差異顯著(P<0.05)，因實驗組L.plantarumP-8一直保持較高活菌數，乳酸菌代謝產生乳酸，大豆蛋白凝固作用形成酸凝膠使黏度較高。

圖2 發酵過程及貯藏期間3種發酵豆乳樣品
黏度變化情況
Fig.2 The viscosity of three groups of fermented soymilk
samples during fermented and storage period

2.4 發酵豆乳樣品在發酵過程、貯藏期間持水性變化情況

發酵豆乳持水性變化是由蛋白質三維網狀結構的凝膠狀態所形成的，蛋白質是將流動性較好的豆乳轉化為半固態發酵豆乳的微觀物質基礎。接種發酵劑不同，乳酸菌代謝產物也會有差異，致使蛋白質會發生不同程度地變性凝集，進而影響發酵豆乳持水性[24]。

圖3 發酵過程及貯藏期間3種發酵豆乳樣品
持水性變化情況
Fig.3 The water holding capacity of three groups of ferm-
ented soymilk samples during fermented and storage period

由圖3可知：3種發酵豆乳樣品在發酵過程中持水性均有顯著變化(P<0.05)。發酵結束時持水性較低，后熟完成后持水性顯著增強(P<0.05)；3組樣品在14 d前持水性呈一直上升趨勢，之后有小幅下降。貯藏期間S10+P-8組持水性較高，與對照組相比具有顯著差異(P<0.05)。這可能與樣品在貯藏期間活菌數、pH值和黏度變化有關，有利于產品貯藏及風味保留。

2.5 發酵豆乳樣品大豆異黃酮含量變化情況

關于大豆異黃酮成分，一般認為大豆苷(daidzin)、大豆素(daidzein)、染料木苷(genistin)、染料木素(genistein)是大豆異黃酮的主要成分，大豆黃苷(glycitin)和大豆黃素(glycitein)生理活性的報道較少，其中大豆苷(daidzin)、大豆黃苷(glycitin)、染料木苷(genistin)屬于糖苷型大豆異黃酮；大豆素(daidzein)、大豆黃素(glycitein)、染料木素(genistein)屬于游離型大豆異黃酮[25]。在4 ℃貯藏期間大豆異黃酮含量變化不顯著，具有一定穩定性，所以本實驗選擇原豆乳、發酵結束和后熟完成進行大豆苷、大豆素、染料木苷、染料木素含量測定。

表2 三種發酵豆乳中大豆異黃酮含量變化情況 單位：μg/mL

注：數據肩不同大寫字母代表組間變化差異性，不同小寫字母代表組內變化差異性。P<0.05。下同。

由表2可知：發酵劑B組樣品4種大豆異黃酮含量變化不顯著。S10+P-8組和發酵劑A組樣品中4種大豆異黃酮含量變化顯著(P<0.05)：大豆苷和大豆素含量測定結果表明，S10+P-8組與發酵劑A組相比變化量更大，差異顯著(P<0.05)。染料木苷和染料木素含量測定結果表明，S10+P-8組與發酵劑A組樣品相比差異不顯著。BAO等[10]研究表明，接種L.plantarumP-8于豆乳中，經發酵作用可促使無生物活性異黃酮轉化為有生物活性的異黃酮，這可能是實驗組比對照組樣品的活性異黃酮轉化量更大原因。

2.6 發酵豆乳樣品質構特性測定結果

利用質構儀檢測3種樣品在貯藏期間質構特性變化，結果如表3所示：在貯藏期間，對照組樣品的4種質構指標變化差異不顯著；S10+P-8組樣品的稠度和黏性與對照組相比具有更高的數值，差異顯著(P<0.05)，其中稠度在1～14 d略有上升，之后有小幅下降。這可能與樣品活菌數和黏度變化有關；S10+P-8組樣品其余3種質構指標在貯藏期間變化不顯著。

表3 貯藏期間3種發酵豆乳樣品質構特性測定結果Table 3 The texture parameters of three groups offermented soymilk samples during fermented andstorage period

2.7 發酵豆乳樣品基本味覺特征總體評價

國外已開始應用電子舌技術進行酸奶品質評價及在線生產監測，國內相關研究仍處于起步階段[26]。本實驗應用電子舌系統檢測經4℃過夜后熟的發酵豆乳樣品的6種基本滋味和3種回味，各滋味指標相對強度分析結果如圖4所示：3種發酵豆乳樣品的基本滋味差異較小，KOBAYASHI等[27]研究發現，使用SA 402B電子舌對食品進行測定時，若2個樣品在某1個滋味指標的相對強度值之差<1，則其差異通過感官品鑒方法不能識別。方差分析結果如表4所示：3種發酵豆乳樣品的鮮味和3個回味無顯著差異；發酵劑B組樣品苦味與其余2組有顯著差異(P<0.05)，有更高滋味強度；S10+P-8組樣品澀味和咸味與對照組相比有顯著差異(P<0.05)，滋味強度更弱；S10+P-8組樣品酸味和甜味與對照組相比有顯著差異(P<0.05)，有更高滋味強度。

圖4 三種發酵豆乳樣品各滋味指標相對強度值的
箱形圖(n=18)
Fig.4 The box plot of relative intensity of each taste index
in three groups of fermented soymilk samples (n=18)

表4三種發酵豆乳樣品各滋味指標相對強度差異性分析
Table4Significantanalysisofeachindexofthreegroups
offermentedsoymilksampleswithstoragetime

項目S10+P-8商業發酵劑A商業發酵劑B酸味-12.38±0.04a-12.91±0.23b-12.83±0.11b苦味0.10±0.01a0.10±0.01a0.40±0.03b澀味0.77±0.01b1.01±0.01a1.04±0.01a咸味-1.29±0.01a-1.49±0.01b-1.48±0.00b甜味5.51±0.07a5.35±0.07b4.09±0.01c鮮味5.71±0.01a5.76±0.01a5.73±0.00a回味-A0.26±0.01a0.24±0.01a0.25±0.01a回味-B-0.34±0.01a-0.36±0.01a-0.33±0.01a豐富度5.01±0.03a5.08±0.01a5.04±0.01a

注：同行不同字母表示差異顯著，P<0.05。

2.8 發酵豆乳樣品感官品鑒

取發酵完成、后熟、7、14、21、28 d時的3種發酵豆乳樣品，進行感官品鑒，評分結果如圖5所示。

圖5 貯藏期間3種發酵豆乳樣品感官品鑒得分情況
Fig.5 The comprehensive score of three fermented soymilk
samples in sensory quality evaluated during storage period

在4 ℃、28 d貯藏期間，各組樣品得分變化差異不顯著，但樣品組間得分存在差異(P<0.05)。其中S10+P-8組和發酵劑A組樣品差異不顯著，高于發酵劑B組。S10+P-8組樣品在貯藏期間黏度較高，有良好的拉絲性，且表面光滑、無臭味及不良異味，酸甜適中，口感平滑細膩。本研究表明：與對照組相比，添加益生菌L.plantarumP8后對發酵產品外觀、氣味、質地等指標有所改善，SAARELA等[28]研究也表明在產品中添加益生菌有助于提高產品感官品質，這與本研究結果相吻合。

3 結論

本研究對復合發酵劑S10+P-8在豆乳發酵期間及貯藏過程的時間、活菌數、酸度、黏度、持水性、活性大豆異黃酮轉化量、質構特性、基本味覺特性進行測定，對感官進行品鑒。與2種商業豆乳發酵劑相比，發酵劑S10+P-8具有良好的發酵特性及貯藏穩定性，且具有更好的活性大豆異黃酮轉化能力，在貯藏期間能提供較高的益生菌活菌數，在發酵豆乳制品開發中具有良好應用潛力。