施用不同微生物菌劑對新疆灰棗中cAMP含量的影響

張少博，宋 健，祿彩麗，楊文英，張劭愷，李建貴

(1.新疆農業大學林業研究所,新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆紅棗工程技術研究中心，新疆 烏魯木齊 830052)

【研究意義】棗(ZiziphusjujubaMill.)屬于“中國五果”之一[1]，是我國第一大干果樹種，原產于我國[2-3]，栽培歷史悠久，因其含有多種化學成分而具有重要的藥用價值，被譽為“木本糧食，滋補佳品”[4-5]。灰棗Zizyphusjujubecv.huizao作為優質的鮮食兼制干品種自引種到新疆，已成為新疆發展紅棗產業的主導品種[6]，其質地密、含水量低、含糖量高、風味佳，還含有多種微量元素，以及維生素C和cAMP(環磷酸腺苷，下同)等多種藥用成分，具有較高的藥用價值和保健作用[7-8]。【前人研究進展】環磷酸腺苷(簡稱cAMP)，1982年陸漢聯分析了多種中草藥植物發現，棗中的cAMP含量最高，達100～600 nmol/mL，對不同品種和采收期的棗肉和棗核進行測試發現，棗肉和棗高[10]。在棗cAMP積累規律研究方面，河北農業大學曲澤洲，王永蕙，劉孟軍[11-12]，山西果樹所趙愛玲等等已有了研究報道[13]。核中的cAMP的含量都隨棗果生長而增加，棗肉中的含量較棗核中的少[9]。1991年劉孟軍等又借助蛋白結合法對14種園藝植物的cAMP含量進行了測定，發現棗中cAMP的含量最大。【本研究切入點】不同品種果實中cAMP存在差異，而本項目組的前期研究進一步表明，棗果中cAMP含量不僅受到基因(品種)的影響，環境因素對cAMP含量的影響也非常顯著，同一品種在不同區域種植的果肉cAMP含量差異可達到一倍[14]，說明通過篩選環境因素，特別是在同一區域內，栽培措施作為影響棗果cAMP含量的主導因子，研究施用微生物菌劑影響灰棗cAMP含量的機制，進而進行人工調控棗果cAMP含量是有意義的。【擬解決的關鍵問題】本研究在前人研究基礎上，以新疆棗主栽品種灰棗為研究對象，開展施用不同微生物菌劑對灰棗中cAMP含量影響的機制研究，為發現影響灰棗中cAMP形成的土壤及施肥因子提供一定的建議與參考，為進一步開展棗果cAMP含量調控研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

庫爾勒市位于新疆維吾爾自治區中部，85°14′10″～86°34′21″E、41°10′48″～42°21′36″N。全市行政區域面積 7268 km2，東西長 127 km，南北寬 105 km。庫爾勒市位于新疆中部。 庫爾勒屬暖溫帶大陸性干旱氣候，總日照數 2990 h，無霜期平均 210 d，年平均氣溫 11.4 ℃，最低為-28 ℃，年平均降水量 58.6 mm，年最大蒸發為 2788.2 mm，主導風向東北風。試驗地位于距庫爾勒市東北方位約25 km的新疆農業大學林業研究所博湖南山試驗基地。試驗用灰棗樹為嫁接三年生。

1.2 供試菌種

供試菌種包括單一功能株菌株和復合微生物菌劑(表1)。所有菌株均來源于新疆農業大學林業研究所微生物實驗室。

1.3 試驗方法

1.3.1 實驗設計 在試驗基地，選取已施9種不同微生物菌劑的灰棗園作為研究對象，施每種微生物菌劑為1個處理，每個處理3個重復，每個重復5棵樹，1個空白處理，不施加任何微生物菌劑，2017年4月15日，各處理每棵棗樹澆灌菌液原液200 mL，澆灌時需用清水將原液稀釋至1000 mL，施入棗樹根部(距樹干15～30 cm，30 cm深)，清水對照加等量清水，全園統一管理，實驗區土壤肥力一致。

在棗果成熟期，采集所對應的的土壤樣品以及灰棗棗果樣品，帶回實驗室，進行土壤理化性質分析，以及棗果中cAMP含量的測定，最后對所得數據，運用統計學方法進行分析，從而得到施用微生物菌劑對灰棗園土壤理化性質以及灰棗中cAMP含量的影響。

1.3.2 棗果中cAMP含量的測定方法 (1)流動相配制精確稱取 9.526 g 的 KH2PO4，溶解于 700 mL 超純水中，加入300 mL甲醇，定容至1000 mL容量瓶，過0.22 μm 濾膜，超聲波脫氣后備用。

(2)標準品溶液配制分別精確稱量cAMP標準品5.0 、8.0 、15.0 、30.0 、50.0 mg，超純水溶解，定容至1000 mL容量瓶。分別取出25 μl 標準品溶液，對其進行UPLC 檢測，對上述5種濃度的樣本溶液分別進行3次進樣，求出平均值。確定色譜條件：色譜柱為pH 2～11，ZORBAX Extend C18 2.1×100 mm 1.8-Micron Rapid Resolution HD 2.1×100 mm 1.8-Micron，流動相為:V(甲醇)∶V(0.1 mol/L磷酸二氫鉀)=10∶90；流速0.6 mL/min，溫度為室溫，進樣量20 μl。在不同波長下，測定cAMP標準品溶液的吸收值，確定最佳檢測波長256 mm 進行測定。依據上述色譜條件進行研究，得到5.0 ～50.0 mg/L 的濃度范圍內，色譜峰面積與樣品量為線性關系，c AMP峰面積為縱坐標(Y)，標準液濃度為橫坐標(X)，依此計算濃度。

表1 不同處理編號Table 1 The serial number of different treatments

表2 不同處理對土壤養分含量的影響Table 2 Effect of different treatments on soil nutrient contents

(3)樣品測定取干燥真空的紅棗樣本進行研磨粉碎，取出1 g 置于100 mL蒸餾水中，進行 100 ℃水浴加熱處理4 h，然后置于3000 r/min 的離心環境下處理5 min，過濾出棗渣，重復進行3次。將3次得到的上清液進行濃縮，得到25 mL 紅棗提取樣本溶液。對樣本溶液進行0.22 μm 濾膜過濾，將所得濾液超聲后上高效液相色譜儀進行測定。

1.4 數據處理與分析

數據采用SPSS19.0軟件和Microsoft Excel 2007進行處理。

2 結果與分析

2.1 不同微生物菌劑處理下土壤因子基本情況分析

不同微生物菌劑處理下土壤因子之間存在一定的差異(表2)。從變異系數來看，不同微生物菌劑處理下，土壤速效磷差異最為明顯，處理9含量最大，空白含量最小；土壤中堿解氮含量差異相對較大，同樣處理9含量最大，空白含量最小；其次電導率，電導率最大為處理9，電導率最低為處理1；土壤速效鉀和交換性鈉含量變異系數較為接近，土壤速效鉀含量最高為處理8，最低為空白，交換性鈉含量最大為處理5，含量最小為處理2；有機質和pH差異性較小，有機質含量最高為處理1，最低為空白，pH最大為處理1，最低為處理4，pH含量都在8.2左右，呈堿性。

2.2 不同微生物菌劑處理下灰棗果實中cAMP含量分析

由圖1可知，不同微生物菌劑處理對灰棗中cAMP含量有不同的影響。相對于空白，無論是單一功能微生物菌劑還是復合微生物菌劑，都會影響灰棗中cAMP含量的提高。就不同微生物菌劑來說，P18(1)處理下灰棗中cAMP含量最高，其次為N22P8P18K7(7)，然后以此為N22(9)、P13(3)、P15P8K7(5)、P13P4K3(6)、P15(2)、K7(8)、P7(4)。

2.3 不同微生物菌劑處理下土壤因子與灰棗果實中cAMP含量相關性分析

在對不同微生物菌劑處理條件下灰棗中cAMP含量和相對應的土壤養分測定的基礎上，對不同微生物菌劑處理條件灰棗中cAMP含量和相對應的土壤指標之間做了初步的相關性分析(表3)。

圖1 不同處理對cAMP含量的影響Fig.1 Effect of different treatments on cAMP contents

表3 不同處理條件下各土壤指標與灰棗中cAMP含量的相關系數Table 3 The correlation coefficient betweencAMP contents and soil nutrient of gray jujube from different treatments

注：* 在 0.05 水平(雙側)上顯著相關。

處理1條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤中速效磷含量成顯著正相關(相關系數r=0.886)，與土壤交換性鈉含量、電導率、pH呈顯著負相關(相關系數分別為r=-0.986、r=-0.996、r=-0.999)；處理2條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤中速效磷含量成顯著正相關(相關系數r=0.984)，與交換性鈉呈顯著負相關(相關系數為r=-0.997)；處理3條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤交換性鈉含量、電導率呈顯著負相關(相關系數分別為r=-0.882、r=-0.995)；處理4條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤中堿解氮含量成顯著正相關(相關系數r=0.901)，與土壤交換性鈉含量、電導率呈顯著負相關(相關系數分別為r=-0.972、r=-0.995)；處理5條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤中堿解氮含量、pH成顯著正相關(相關系數r=0.986、r=0.931)，與土壤交換性鈉含量呈顯著負相關(相關系數r=-0.914)；處理6條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤電導率呈顯著負相關(相關系數分別為r=-0.887)；處理7條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤pH呈顯著負相關(相關系數分別為r=-0.998)；處理8條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤中堿解氮、速效磷、速效鉀含量成顯著正相關(相關系數分別為r=0.956、r=0.998、r=0.973)，與土壤有機質含量，電導率呈顯著負相關(相關系數分別為r=-0.886、r=-0.956)；處理9條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤中堿解氮含量、pH成顯著正相關(相關系數r=0.997、r=0.919)，與土壤有機質含量呈顯著負相關(相關系數分別為r=-0.996)；處理10條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤中堿解氮、速效磷含量(相關系數分別為r=0.851、r=0.999)，與土壤交換性鈉含量呈顯著負相關(相關系數分別為r=-0.996)。

2.4 不同土壤類型條件下影響灰棗果實品質的土壤因子的篩選和回歸方程建立

不同微生物菌劑處理條件下，土壤養分與果實品質都分屬于不同的正態分布總體，根據近代回歸分析理論[15]，若某一正態總體中因子間的相關系數R≥0.70，就會存在多重共線問題，容易導致在偏系數很不顯著的同時，總回歸顯著，甚至出現有些系數的符號與實際情況相矛盾，因此還需要用主成分回歸、典型相關、嶺回歸等近代回歸方法建立方程。

本研究應用多元逐步回歸分析方法，以土壤堿解氮(x1)、速效磷(x2)、速效鉀(x3)、有機質(x4)、pH(x5)、電導率(x6)、交換性鈉(x7)為一總體；cAMP含量(y1)為一總體，分別篩選出不微生物菌劑處理條件下影響cAMP含量的土壤因子，將篩選出來的因子與cAMP含量建立回歸方程，并進行顯著性檢驗，均達到極顯著水平，說明建立的方程可靠。篩選出不同微生物菌劑處理條件下影響灰棗中cAMP含量的土壤因子并建立回歸方程(表4)。

生態系統中各生態因子之間的關系較為復雜，不同微生物菌劑處理對土壤因子有一定的影響，土壤中不同的生態因子相互影響并綜合作用于果實品質的形成，同樣對cAMP含量有一定的影響。在進行多元逐步回歸分析時，分析按照α=0.10水平，所顯示的結果均有顯著性意義。10種不同微生物菌劑處理條件下，只有處理1、處理2、處理8、處理9，以及空白處理10條件下，土壤因子與棗果中cAMP含量之間表現出不同的相關性。

表4 不同處理條件下土壤養分與灰棗果實品質多元線性逐步回歸分析結果Table 4 Result of the multiple linear regression analysis between fruit quality and soil nutrient of gray jujube from different treatments

處理1條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤中速效磷含量、pH成顯著正相關；處理2條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤中堿解氮含量、交換性鈉成顯著正相關；處理8條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤中堿解氮含量呈顯著正相關，與有機質含量成顯著負相關；處理9條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤中堿解氮含量、速效鉀含量呈顯著正相關；處理10條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤中交換性鈉、pH呈顯著正相關。

3 結 論

處理1條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤中速效磷、土壤交換性鈉含量、電導率相關；處理2條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤中速效磷含量、交換性鈉相關；處理3條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤交換性鈉含量、電導率相關；處理4條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤中堿解氮含量、土壤交換性鈉含量、電導率相關；處理5條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤中堿解氮含量、pH、土壤交換性鈉含量相關；處理6條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤電導率相關；處理7條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤pH相關；處理8條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤中堿解氮、速效磷、速效鉀、土壤有機質含量，電導率相關；處理9條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤中堿解氮含量、pH、土壤有機質含量相關；處理10條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤中堿解氮、速效磷含量、土壤交換性鈉含量相關。

通過多元逐步回歸分析可知，9種不同微生物菌劑以及空白處理條件下，只有處理1、處理2、處理8、處理9，以及空白處理10條件下，土壤因子與棗果中cAMP含量之間表現出不同的相關性。處理1條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤中速效磷含量、pH相關；處理2條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤中堿解氮含量、交換性鈉相關；處理8條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤中堿解氮含量、有機質含量相關；處理9條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤中堿解氮含量、速效鉀含量相關；處理10條件下，灰棗棗果中cAMP含量與土壤中交換性鈉、pH呈相關。

4 討 論

土壤微生物是生態系統中的分解者，它們分解有機質，釋放養分，促進植物利用，抑制病毒等[16-17]。微生物菌株的施用，可以改善土壤養分供給和土壤微生物數量等，促使土壤微生物區系修復到健康的狀態，促進土壤微生態系統平衡發展[18]，進而對灰棗中cAMP含量產生影響。本試驗的結果表明，無論是單一功能微生物菌劑還是復合微生物菌劑，都會影響灰棗中cAMP含量的提高。就不同微生物菌劑而言，P18(1)處理下灰棗中cAMP含量最高，其次為N22P8P18K7(7)，然后以次為N22(9)、P13(3)、P15P8K7(5)、P13P4K3(6)、P15(2)、K7(8)、P7(4)。

綜上所述，施用微生物菌劑可以改善土壤土壤環境，促進土壤生態系統平衡健康發展，從而促進植物生長發育[19]。施用微生物菌劑可以有效提高灰棗中cAMP的含量，不同微生物菌劑處理條件下，灰棗中cAMP的含量與土壤養分因子之間表現不一樣的相關性，進行多元線性回歸分析發現，只有部分微生物菌劑處理條件下，灰棗中cAMP的含量與土壤養分之間表現一定的相關性。本研究僅限于對不同微生物處理條件下對灰棗中cAMP含量以及其與土壤養分之間的關系進行了分析與研究，但是，具體針對不同微生物菌劑如何影響土壤環境，以及如何具體通過使用微生物菌劑對灰棗中cAMP含量進行有效提高，需要進一步的實驗與研究。