水解膠原蛋白分子量控制技術的研究

石金扣

摘 要：在鉻革屑中具有較多的膠原蛋白，因此通過合理的手段在鉻革屑中進行膠原蛋白的提取，并進行有效的利用，是合理應用制革廢屑的有效途徑之一。當前階段可通過在鉻革屑中進行膠原蛋白的提取，制作成醫用膠原蛋白。

關鍵詞：膠原蛋白；實驗儀器；分子量控制

1 膠原蛋白結構

在自然界中最為豐富的一種蛋白質便是膠原蛋白，是一種呈白色的纖維性質的生物高分子物質。動物機體的各個組織中均含有膠原蛋白，如動物皮膚、骨骼和韌帶等部位，具有一定的結構型和力學性質，因此在動物生命活動中，膠原帶白發揮了自身的重要作用。當前階段經過相關的研究已發現十九種以上的膠原蛋白，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型的膠原蛋白時最為常見的膠原帶白類型，生皮中的膠原蛋白則主要為Ⅰ、Ⅲ型。其中在生皮中含量最豐富的便是Ⅰ型膠原蛋白，在其基本結構中的三股螺旋結構主要是由三條α多肽鏈構成的，且每條α肽鏈均為左手的螺旋構型。三條具有一定獨立性的左手螺旋肽鏈通過互相纏繞的方式形成右手螺旋的結構，也就是膠原蛋白的三股螺旋結構。該螺旋結構具有一定的特殊性，并和二硫鍵、氫鍵等相互作用，從而使膠原帶白所具有的機械強度得到了一定的保障。

2 水解膠原蛋白分子量控制的研究

2.1 實驗儀器和材料

（1）實驗儀器。本次實驗選擇的是北京華陽利民有限公司生產的型號為CL1030的毛細管電泳儀，美國安捷倫公司生產的液相色譜儀、江蘇榮華儀器制造有效公司生產的水浴恒溫振蕩器、上海精密科學儀器有限公司生產的數顯PH計、北京普析通用儀器有限責任公司生產的分光光度計、昆山市超聲儀器有限公司生產的超聲波清洗機、上海貝凱生物化工設備有限公司生產的恒溫浴鍋、北京雅士林試驗設備有限公司生產的電熱恒溫鼓風干燥箱以及日本生產的電子分析天平。

（2）實驗材料。本次實驗所使用的主要材料為河北東明實業集團生產的鉻鞣鉻屑。所使用的實驗試劑有北京化工廠生產的氫氧化鈉、氧化鎂、氫氧化鈣、濃度為98%的硫酸、以及鹽酸，北京化工試劑有限公司生產的氧化鈣，西隴化工股份有限公司生產的四硼酸鈉，以上作為分析純。北京奧博星生物技術有限責任公司生產的堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶，以及西隴化工股份有限公司生產的低分子量的標準蛋白質和超低分子量的蛋白質共同作為生化試劑。

2.2 實驗方法

（1）鉻革屑的理化性質。首先測定其中的灰分，烘干膠原蛋白溶液，并對其總固體的重量進行測定，通過電爐進行碳化，之后通過馬弗爐進行灰化。對灰化后的重量進行測量，其在總固體重量中所占的百分比，即為灰分的含量。之后測定鉻的含量，將試樣進行灰化，之后在熔融的狀態下，即溫度為400攝氏度的條件下，通過氯酸鉀實現三價鉻到六價鉻的氧化。在高溫條件下會將過多余的氯酸鉀分家，之后通過分光光度法進行六價鉻含量的測定。然后測定其中的水分，此時應按照國家相關的標準法烘箱法進行。最后測量其PH值，可對革試樣的浸出液的PH值進行測定，將其作為革的PH值。

（2）膠原蛋白的提取。可通過以下幾種方法對其中的較膠原蛋白進行提取：其一便是通過堿法水解對膠原蛋白進行提取，取10克左右的革屑粉碎后加入濃度為6%的堿劑，并在85攝氏度的環境下進行5個小時的水解。冷卻水解后的溶液并進行過濾，獲取具有一定粘稠性的水解膠原液，將其烘干獲得膠原蛋白粉末。其二便是通過堿酶法水解對膠原蛋白進行提取，取10克左右的革屑粉碎后加入濃度為4%的堿劑，之后在80攝氏度的環境下，在水浴恒溫振蕩器內進行3個小時的水解。水解后將溫度降到適合酶的溫度，然后將堿劑、硫酸加入進去，將PH至調節到適合酶的PH值。將0.05克的酶加入進去，并進行1個小時的反應。水解溶液冷卻后進行過濾，獲取具有粘稠性的水解膠原液，將其烘干獲得膠原蛋白粉末。其三便是通過酸法進行膠原蛋白的提取，取出10克的革屑粉碎后向其加入約為0.3毫升的硫酸或0.8毫升的草酸，在80攝氏度的環境下，在水浴恒溫振蕩器中進行2個小時的水解。完成反應后將氧化鈣加入，從而對反應液的PH值進行調節。通過高溫進行加入直至藍色溶液轉變為淡黃色溶液，并出現淺藍色的沉淀。水解液冷卻后進行過濾，將獲取的具有粘稠性的水解膠原液進行烘干，從而獲得膠原蛋白粉末。其四便是通過酸酶水解法進行膠原蛋白的提取，向粉碎的10g革屑中加入0.2ml的硫酸（或0.7g的草酸），80°C下在水浴恒溫振蕩器中水解2h，將溫度降至酶的最適溫度，加入NaOH或相應的酸（硫酸（98%）、草酸）調反應液的pH至酶的最適pH，加入0.1g的酸性蛋白酶反應1h。反應完之后，加入Ca（OH）2調節反應液的pH值在10左右，高溫加熱，直到藍色的溶液變為淡黃色，并且有淺藍色沉淀為止。將水解液冷卻過濾，得到粘稠的水解膠原液，烘干，得到膠原蛋白粉末。還需要對提取率進行測定，提取率表明革屑的水解程度。水解反應前鉻革屑質量記為mj，水分質量記為m2，灰分質量記為m3。水解反應結束后，過濾，將水解液烘干，稱重，即膠原蛋白的質量記為m4（灰分含量很少，可以忽略不計），按下面公式計算提取率。

提取率=■×100%

3 毛細管電泳技術測定膠原蛋白樣品的分子量

3.1 新毛細管的處理方法

為降低新制成的毛細管內壁表面硅羥基解離對電滲產生的影響，在正式實驗前要對毛細管進行老化處理，具體過程如下：

先用重蒸水沖洗20min后用0.1mol/L的HCl溶液沖洗30min；再用重蒸水沖洗沖洗5min后，用0.1mol/L的NaOH溶液沖洗30min；最后用電泳緩沖液沖洗20min。

3.2 實驗過程中毛細管處理方法

在實驗過程中毛細管柱要經常沖洗，每進樣一次，需沖洗一遍毛細管，具體程序如下：

每天在使用前，先用重蒸水沖洗10min后，用0.1mol/L的HCl溶液沖洗10min先用0.1mol/L的NaOH沖洗10min，最后用緩沖液沖洗10min。

在實驗過程中，每進樣一次后，要用0.1mol/L的HCI溶液沖洗1min，0.1mol/L的NaOH沖洗1min，最后用緩沖液沖洗1min后才可進樣。

當出現基線非常不穩定或者蛋白質吸附情況嚴重時，可對毛細管再次進行老化處理。

3.3 實驗結束后毛細管處理方法

首先用0.1mol/L的HCl沖洗10min，用重蒸水沖洗5min；再用0.1mol/L的NaOH沖洗10min，重蒸水沖洗5min后將其兩端浸泡于重蒸水中。

4 結束語

毛細管電泳實驗后得出堿-酶法從鉻革屑中提取的膠原蛋白的平均分子量集中在2300～3300Da之間。酸法水解提取膠原蛋白的研究結果表明，提取條件為硫酸用量0.3ml（草酸用量8%），反應溫度80°C，反應時間2h，此時膠原蛋白的提取率為80%左右，在毛細管電泳條件相同的情況下，硫酸和草酸水解提取膠原蛋白的分子量分布大體一致；草酸提取的膠原蛋白可控制其分子量在20kD左右，而硫酸提取的膠原蛋白可控制其分子量在15KDa左右。由以上數據可以得出，酸法提取的膠原蛋白可以控制其分子量分布比較集中，分子量的最大含量已經達到60%以上。

參考文獻

[1]水解膠原蛋白分子量控制技術的研究[D].天津科技大學，2014.

[2]黃惠君.水解膠原分子量測定方法的探討[J].明膠科學與技術，2010，30（1）：35-42.

[3]張素風，王群，王學川，etal.水解膠原蛋白乳化性和乳化穩定性研究[J].陜西科技大學學報，2014（4）：10-13.

[4]張慧潔，丁志文，龐曉燕，etal.水解膠原蛋白及其表征的研究進展[J].皮革與化工，2013，30（1）：17-21.