殼聚糖基復合水凝膠在創傷修復中的應用

張冬英，盧思彤，胡章，李思東，李普旺

(1.廣東海洋大學 化學與環境學院，廣東 湛江 524088；2.中國熱帶農業科學院 農產品加工研究所，廣東 湛江 524001)

皮膚創傷、燒傷、手術等對人體有嚴重的健康風險，因為隔熱，體液潴留和對外源性病原體的保護都依賴于完整的皮膚屏障功能，在手術后傷口護理、燒傷、外部創傷和長期不愈性潰瘍等多方面都需要創傷敷料。理想的傷口敷料應保護傷口免受細菌感染，提供濕潤和愈合的環境，以減少疤痕形成的風險，具有生物相容性，可促進一系列修復細胞增殖、遷移、以及組織重建等[1]。同時，傷口敷料在使用過程中也應表現出機械穩定性，方便使用和去除，能作為微生物、異物、組織損傷力等外部威脅的屏障[2]。多方面的研究旨在努力開發改進臨床相關治療的方法，達到控制感染和實現急性與慢性傷口的更快愈合的敷料。

水凝膠是指一類由物理或化學交聯形成的三維高分子網絡體系，性質柔軟，能吸收大量的水分并能保持一定的形狀。其主要特點有：①高分子基質以物理或化學交聯形成的網絡結構，網絡中充滿不能自由流動的溶劑，表現出彈性或黏彈性的半固體性質；②對溫度及外界條件敏感；③具有溶脹性、脫水收縮性、觸變性、粘合性；④具有易涂展、舒適感、無油膩、易去除，能吸收組織滲出液，不妨礙皮膚的正常生理作用，具有一定的保水作用而促進藥物透皮吸收[3]。殼聚糖(CS)是由甲殼素經脫乙?；笾频玫奶烊痪坳栯x子多糖，具有良好的促進創傷愈合、抑制瘢痕形成、凝血性、抑菌性等多種作用，是一種生物相容性好、無免疫原性、無刺激性的多功能材料，2001年被美國FDA確認屬于GRAS(通常公認為是安全的)物質[4]。本文將近年來殼聚糖通過物理或化學方法復合溫敏性材料、仿生部分等制備的水凝膠膠材料在創傷修復的研究進展進行綜述和討論，為進一步開展相關研究工作奠定基礎。

1 殼聚糖基溫敏性水凝膠

溫敏性水凝膠是眾多環境敏感水凝膠中被研究最多的水凝膠之一，主要特點是可以響應溫度變化而發生溶膠-凝膠轉變[5]。隨著人們對生物醫藥材料要求的提高，進一步將溫敏性水凝膠作為凝膠體系的研究更加廣泛，在生物醫學材料領域受到廣泛的關注。相比傳統水凝膠，溫敏水凝膠應用于組織工程、藥物遞送、3D細胞培養等領域具有顯著的優越性。

1.1 殼聚糖/β-甘油磷酸鹽溫敏水凝膠

殼聚糖有良好生物相容性、低細胞毒性和生物體內可降解性等優點。Chenite等[6]提出了一種基于CS/多元醇鹽組合的熱敏性水凝膠的新制備方法，成功將CS溶液與β-甘油磷酸鈉(β-GP)溶液混合，在室溫，pH 7.15 時不會發生溶膠-凝膠轉化，當溫度提升至37 ℃時，可迅速凝膠化。當應用在體內注射時，液體制劑原位形成凝膠植入。該凝膠系統可用于在體內遞送生物活性生長因子以及組織工程應用的細胞包封基質等，屬于一種與生物高度相容的新型熱敏性凝膠體系。

為了防止過熱、聚焦超聲治療的副作用，Huang等[7]通過使用CS、β-甘油磷酸鹽和甘油開發了一種雙功能熱敏水凝膠。通過調整水凝膠的組成使溶膠-凝膠轉變溫度與生理溫度一致作為熱信號，獲得優化配方即0.5%CS、5%β-甘油磷酸鹽、25%甘油組成的水凝膠具有接近人體皮膚的高聲阻抗，衰減系數遠低于人體皮膚，超聲波傳輸從25～55 ℃保持在99%。這些特性確保了該水凝膠具有防止過熱、聚焦超聲的雙重功能。Liu等[8]通過殼聚糖-4-硫代丁基脒(CS-TBA)與羥基磷灰石(HA)和β-GP共混，獲得機械性能較未改性CS更好的溫敏水凝膠。以牛血清白蛋白(BSA)模擬蛋白質釋放的結果表明，CS-TBA/HA/β-GP 相比CS/HA/β-GP水凝膠具有更長的持續釋放時間，這可能與CS-TBA和BSA間形成的二硫鍵有關。CS-TBA/HA/β-GP水凝膠具有多孔結構，均勻分布的納米羥基磷灰石，適當的降解速率和低細胞毒性，在藥物遞送和組織工程的應用中有一定的潛力。

硫酸軟骨素在觸發血管修復和細胞遷移中起著重要作用[9-10]。其還具有抗氧化和抗凋亡活性，并在免疫反應中如生長因子活性調節和白細胞募集等發揮作用[11]。通過將碳酸氫鈉與β-甘油磷酸酯組合，合成了具有顯著機械性能和快速凝膠化速率的殼聚糖水凝膠。Alinejad 等[12]為了改善它們的生物學性能，通過相對簡單快速的方法開發了一種主要由殼聚糖與硫酸軟骨素組成的熱敏和可注射水凝膠。通過評估包封L929細胞的活力和代謝活性來評估添加硫酸軟骨素對水凝膠細胞相容性的影響，其pH和重量摩爾滲透壓濃度接近生理水平并增強溶脹能力，包封的細胞能夠維持活力和增殖能力長達7 d，硫酸軟骨素的添加在無血清條件下顯著改善細胞活力。該研究證明，用碳酸氫鈉和β-甘油磷酸酯的組合制備的殼聚糖-硫酸軟骨素水凝膠具有作為熱敏、可注射和生物相容性基質的潛力。

氧化纖維素納米纖維(TOCNF)是一種天然材料，具有許多有前景的特性，包括生物相容性和降解性。Nguyen等[13]將不同濃度的TOCNF與CS結合，通過與β-甘油磷酸酯之間的相互作用構建了一種用于生物醫學方面的熱敏可注射水凝膠，這種水凝膠可以在體溫下進行溶膠-凝膠轉變。TOCNF的加入縮短凝膠化時間并增加了孔隙率。與單獨CS水凝膠相比，這些含有TOCNF的水凝膠在體外和體內均顯示出良好的生物相容性。體內植入7 d后，發現CS/TOCNF出現初始輕微炎癥反應，隨著時間推移，這種反應在14 d內基本消退。水凝膠內的細胞浸潤也是顯著的，植入后14 d顯示出活化巨噬細胞，并具有抗炎和傷口愈合能力。由此表明，添加TOCNF可顯著提高CS水凝膠作為生物醫學材料的生物相容性。

1.2 改性殼聚糖溫敏水凝膠

熱敏羥丁基殼聚糖(HBC)是一種殼聚糖衍生物，具有可逆的溫度響應特性和生物相容性。Sun 等[14]為了增強熱敏羥丁基殼聚糖(HBC)水凝膠的機械強度，添加甲殼素晶須制備熱敏羥丁基殼聚糖/甲殼素晶須(HBCW)水凝膠，HBCW水凝膠顯示出堅固的層狀形狀。通過振蕩應力掃描研究了溫度、pH值和NaCl濃度對HBCW水凝膠機械強度的影響。結果表明，HBCW水凝膠在37 ℃，pH 12.0時可達到最大剛度(～1 126 Pa)。低pH和高鹽離子會降低水凝膠的穩定性，而幾丁質晶須可以增加HBCW水凝膠的應力耐受性和相關的破裂應變性。

理想的敷料應具有合適的機械性能、抗感染性和組織相容性好等特征，同時，醫生更喜歡能夠為傷口愈合提供合適的濕潤微環境的敷料。為此，Xia等[15]開發了幾丁質晶須(CW)/羧甲基殼聚糖納米粒子(CMCS NPs)/熱敏羥丁基殼聚糖(HBC)復合水凝膠(CW/NPs/HBC-HG)作為治療慢性傷口的敷料。在引入CW時，復合水凝膠的凝膠溫度顯著降低和機械性能增強。在37 ℃下，CW/NPs/HBC-HG的儲能模量(G0)是NPs/HBC-HG的3.6倍。利奈唑胺是一種廣譜抗生素，直接溶于復合水凝膠的水相中，復合水凝膠對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性達到99%，且維持7 d。當重組人表皮生長因子(rhEGF)被包封到NPs中時，CW/NPs/HBC-HG水凝膠可提供長達5 d的細胞增殖活性。更重要的是，糖尿病大鼠的慢性傷口愈合模型評估顯示，CW/NPs/HBC-HG敷料促進傷口愈合并加速再上皮化、膠原沉積和血管生成。這些研究結果表明，CW/NPs/HBC-HG水凝膠是一種有前途的慢性傷口敷料。

聚(N，N-二乙基丙烯酰胺)(PDEAAm)在水介質中響應其低臨界溫度(LCST)附近的溫度變化而經歷可逆的水合-脫水。Ngadaonye 等[16]在殼聚糖存在下通過快速光聚合交聯PDEAAm來合成熱響應互穿聚合物網絡敷料。該敷料透明，可透過水蒸氣，但不可滲透細菌。它們具有溫度依賴性和溶脹性能，且在低溫下膨脹并變得較少粘合，可調節粘附性的這種能力將促進從傷口部位、特別是燒傷和供體部位去除的無創傷方式?？咕钚匝芯孔C明該敷料控制摻入的抗生素釋放的能力，可以通過抑制細菌生長來增強傷口愈合能力。

傷口感染一直是一個常見且高成本的問題。溫度敏感性水凝膠因其具有易成型性、易于給藥和在傷口上保持潮濕的局部環境，被證明是一種合適的敷料候選者。Zhao等[17]成功制備了一種新型負載β-環糊精-姜黃素的熱敏性殼聚糖水凝膠，表征其具有多孔內部結構和持續的姜黃素釋放曲線。在大鼠的傷口感染模型中研究了水凝膠的傷口愈合能力。經分析，凝膠復合物的傷口表現出更高的傷口閉合率，這與觀察到改善組織學結果相平行。此外，體外抗微生物、抗氧化、蛋白質印跡分析和逆轉錄-定量聚合酶鏈反應測定的結果表明，水凝膠復合物具有不同的抗氧化、抗微生物和抗核因子-κB信號傳導能力。這些結果表明，這種新型水凝膠是促進皮膚傷口愈合的合適候選者。

殼聚糖基熱敏水凝膠被稱作為可注射的原位凝膠聚合物。Wang等[18]使用殼聚糖、羥丙基甲基纖維素和甘油制備了一種熱敏性水凝膠，其在pH為6.8～6.9，溫度為37 ℃條件下凝膠時間為15 min。通過FTIR、XRD、SEM、流變儀表征該熱敏水凝膠的分子結構、流變行為、內部結構形態等，進一步研究其降解性、細胞毒性及蛋白質釋放行為，研究結果表明，該熱敏水凝膠具有良好的流動性、熱敏性、可降解性及低細胞毒性和可控釋性，顯示出在醫學應用中的潛在用途。

2 殼聚糖復合仿生部分水凝膠

將仿生部分通過物理或化學方法引入水凝膠或支架已廣泛賦予創傷修復敷料的生物學活性。

2.1 復合生長因子水凝膠

合適的微環境將促進細胞增殖和遷移，這有利于早期傷口愈合并防止炎癥和疤痕產生。Hu等[19]通過靜電相互作用和二價螯合，采用羧甲基殼聚糖(CMC)、海藻酸鈉(ALG)和氯化鈣制備一系列雙交聯無定形CMC-ALG水凝膠，并進一步加載表皮生長因子(EGF)?？疾炝嗽撍z在流變學、溶脹性、保水性、EGF釋放和細胞增殖等性能，表明這種無定形水凝膠可以促進細胞增殖并加速傷口愈合，顯示出在傷口護理管理方面很有前景。

脂肪來源的干細胞(ASCs)分泌幾種血管生成生長因子，可用于治療缺血性組織，然而，解離的ASCs移植經常導致細胞快速死亡。Cheng等[20]為了開發一種能夠讓ASCs持續釋放，用于促進血管生成的熱敏性殼聚糖/明膠水凝膠，將熱敏殼聚糖水凝膠中混合明膠，增強了包封ASC細胞的活力。在體外培養期間，明膠的逐漸降解導致ASC從殼聚糖/明膠水凝膠中持續釋放。體外傷口愈合測定顯示，相比殼聚糖水凝膠，包封在殼聚糖/明膠水凝膠中的ASC共培養的成纖維細胞顯示出更快的細胞遷移。另外，在包封ASC的殼聚糖/明膠水凝膠的上清液中發現更高濃度的血管內皮生長因子。使用包封ASC的殼聚糖/明膠水凝膠后，小雞胚胎絨毛尿囊膜測定和小鼠傷口愈合模型顯示出更高的毛細血管密度。相對于單獨的ASC或包封ASC的殼聚糖水凝膠，在施用包封ASC的殼聚糖/明膠水凝膠后第5 d在傷口組織中也發現更多的ASC。因此，殼聚糖/明膠熱敏水凝膠不僅維持ASC存活，還能夠持續釋放ASC用于促進血管生成應用，從而在治療缺血性疾病方面表現出巨大的臨床潛力。

為了使骨髓間充質干細胞(BMSCs)在慢性傷口的治療中發揮其全部潛力，Chen 等[21]開發了基于生物相容性多功能交聯劑的溫度敏感性水凝膠，并用于遞送BMSC，來改善傷口的慢性炎癥微環境。研究發現水凝膠與BMSCs結合處理傷口后，載有BMSCs水凝膠組中觀察到明顯更大的傷口收縮。組織學和免疫組織化學結果證實，該治療通過促進肉芽組織形成、血管生成、細胞外基質分泌、傷口收縮和再上皮化來促進糖尿病皮膚傷口的快速愈合。這些結果表明載有BMSC的水凝膠可能是治療糖尿病潰瘍的有希望的治療策略。

促進血管生成治療法具有生成側支血管系統的潛力，是治療肢體嚴重缺血的有效途徑。熱響應性水凝膠可以為藥物的持續釋放提供原位儲庫，并為包封的活性物質提供保護和內聚。人間充質干細胞(hMSCs)在體內、體外具有強烈的血管生成潛力，去鐵胺(DFO)是促血管生成缺氧誘導因子-1α途徑的藥理學活化劑，已在體內有效顯示出促血管生成的效果。Hastings等[22]將hMSC和DFO與熱響應性殼聚糖/β-甘油磷酸鹽水凝膠結合，起到可注射、多模式促血管生成治療劑的作用，用于治療肢體嚴重缺血。該凝膠在33 ℃開始進行熱凝膠化，并在7 d內提供持續生物活性DFO的釋放，同時允許包封hMSC的存活、增殖和遷移。包封在含有100 μmol/L DFO殼聚糖熱響應水凝膠中的hMSC顯示出VEGF表達上調。水凝膠中hMSC和DFO的組合導致生物活性協同增強，該熱敏性水凝膠復合制劑顯示出在治療肢體嚴重缺血的顯著潛力。

Zhu等[23]為了開發出良好的真皮替代品，成功制備了模仿人體細胞外基質的水凝膠，可用于組織工程皮膚支架。通過使用轉谷氨酰胺酶作為交聯劑，將透明質酸(HA)和羧化殼聚糖加入到人類膠原(HLC)中來合成水凝膠，可用于組織工程皮膚支架。研究證明，水凝膠具有良好的生物相容性，可以有效地防止外部細菌侵入傷口，減少炎癥反應，且該水凝膠是柔軟且多孔的材料，在皮膚修復、藥物遞送、軟骨治療和其他組織工程應用中表現出良好的潛力。

2.2 復合多肽水凝膠

我國海洋生物資源豐富，大量海產品中含有結構獨特、功能強大的天然活性物質。每年新發現的海洋多肽類化合物在海洋天然產物中占有很大的比例，是海洋活性物質研究的重要組成部分。越來越多的研究表明，這些活性產品具有促進傷口愈合、止血、抗菌等功能，有望開發出多種新型天然海洋功能材料。

多肽SIKVAV是一種衍生自層粘連蛋白A蛋白鏈的肽，并顯示出多種生物活性。Lin等[24]發現SIKVAV肽能夠促進內皮細胞的粘附和分化，還可以誘導內皮細胞的血管形成，并介導缺血組織的血運重建。研究表明SIKVAV肽是一種有前途的功能單元，可以與底物結合，改善血管生成和細胞粘附能力。血管生成和再上皮化是皮膚傷口愈合的關鍵因素。Chen等[25]報告了SIKVAV肽-共軛殼聚糖水凝膠的仿生片段，可以促進皮膚再生。體外研究發現這種肽綴合的水凝膠顯著促進BMSC粘附和增殖。在體內該水凝膠加速傷口收縮。皮下植入實驗和H&E染色結果顯示肽修飾的殼聚糖水凝膠顯著促進新血管的形成。此外，Masson染色顯示許多新生膠原纖維出現在肽-共軛水凝膠組中，而在對照和殼聚糖水凝膠組中僅發現少量新生膠原纖維。同時，肽-殼聚糖水凝膠組快速上皮化，而對照和殼聚糖水凝膠需要更多時間才能完成。這些結果表明，SIKVAV 肽能顯著改善殼聚糖在血管生成和皮膚再上皮化中的功能。

Chen等[26]研究了SIKVAV肽在體外可以促進成纖維細胞的細胞增殖和遷移，膠原合成以及多種生長因子分泌的能力。隨后，進一步研究了SIKVAV肽修飾的殼聚糖水凝膠促進體內皮膚傷口中生長因子的分泌[27]。結果表明，SIKVAV肽修飾的殼聚糖水凝膠可用于傷口敷料和皮膚傷口的治療，是有希望的合成生物材料，用于治療皮膚傷口。

Liu等[28]以微生物轉谷氨酰胺酶(MTGase)為催化劑，將膠原肽(COP)分子接枝到殼聚糖氨基上，得到水溶性殼聚糖-膠原肽(CS-COP)衍生物。再通過CS-COP的氨基與氧化魔芋葡甘聚糖(OKGM)的活性醛基之間發生席夫堿反應制備得該復合水凝膠。這種新型水凝膠樣品具有清晰穩定的三維網狀結構。同時，研究了添加OKGM對該水膠凝的凝膠時間、溶脹行為、水蒸發速率和凝血能力的影響。該水凝膠顯示出良好的溶脹能力、適當的保水能力和良好的凝血能力。此外，細胞毒性實驗結果表明該水凝膠具有優異的生物相容性。因此，該水凝膠具有作為傷口敷料應用的潛力。

臨床上需要對糖尿病患者的慢性傷口進行更有效的治療，糖尿病通常涉及內皮功能障礙，因此，靶向再上皮化可以改善當前治療的效果。Xiao等[29]提出了一種來自血管生成素-1的整合素肽QHREDGS作為糖尿病傷口治療的治療候選者，通過研究證明在體外QHREDGS肽促進角質形成細胞粘附和集體遷移，以及通過Akt和MAPKp42/44途徑對H2O2應激的存活。在體內，固定在殼聚糖-膠原水凝膠上的QHREDGS肽通過加速再上皮化和肉芽組織形成而促進糖尿病傷口愈合。在正常和糖尿病人原代角質形成細胞和db/db糖尿病小鼠模型的研究結果證明了QHREDGS肽在治療糖尿病傷口中的潛力。

3 殼聚糖復合其他材料水凝膠

Chen等[30]利用氧化海藻酸鹽(OAlg)和羧甲基殼聚糖(CMCS)的醛和氨基之間的席夫堿反應來凝膠化，通過乳液交聯法制備負載四環素鹽酸鹽(TH)的明膠微球(GMs)，然后整合到OAlg-CMCS水凝膠中以制備抗菌和可生物降解的復合水凝膠敷料，用于藥物遞送和傷口愈合。隨著微球比例從10～40 mg/mL的增加，復合敷料表現出較短的膠凝時間和較低的溶脹比，以及較高的機械強度。特別是含有30 mg/mL四環素鹽酸鹽的明膠微球復合水凝膠敷料，在治療細菌感染方面具有廣闊的前景。

在傷口愈合的過程中非常需要多功能的敷料，包括抗感染、抗氧化和促進傷口愈合過程等，然而其設計仍然是一個挑戰。Zhao等[31]開發了一系列基于季銨化殼聚糖-g-聚苯胺(QCSP)和苯甲醛官能化的可注射導電自愈合水凝膠，研究發現這些水凝膠具有良好的自愈合性、電活性、自由基清除能力、抗菌活性、粘合性、導電性、溶脹率和生物相容性。

Noori等[32]為了克服傳統傷口敷料的限制而努力開發現代傷口敷料。智能納米復合水凝膠就是合適的候選者。他們采用凍融法制備了蜂蜜負載PVA/殼聚糖/蒙脫土響應納米復合水凝膠，并作為一種新型傷口敷料系統，進一步研究評估了其物理、機械、溶脹和釋放行為。研究了以蜂蜜為藥物模型的合成納米復合水凝膠的形態和性質。通過X射線衍射法證實了納米復合材料的剝落形態。20 ℃和37 ℃時在各種pH下進行溶脹研究，結果表明，溫度升高導致膨脹增加，pH值達到2時出現最大膨脹。在相同條件下也研究了蜂蜜的體外釋放，相應的結果表明在較高pH值下蜂蜜釋放速率更快。MTT實驗結果顯示在納米復合水凝膠系統中沒有表現出細胞毒性，抗菌活性的研究表明，該系統的抗菌活性超過99%。體內研究結果證實了該復合水凝膠系統的傷口愈合能力。研究結果表明所提出的納米復合水凝膠系統的特性是使其成為傷口敷料的理想選擇。

一氧化氮(NO)是一種參與多種生物信號通路的內源性分子。在低濃度(皮摩爾至納摩爾)下，NO具有調節功能，如促進血管舒張、傷口愈合、細胞增殖、抑制血小板粘附和聚集等。在較高的濃度(微摩爾至毫摩爾)下，NO具有抗腫瘤和抗菌作用[33]。因此，NO被認為是傳統抗菌藥物的有前途的替代品。NO是一種自由基，設計藥物以受控的空間和時間產生治療量的NO仍然是一個挑戰。Pelegrino 等[34]將NO供體S-亞硝基谷胱甘肽(GSNO)摻入到熱響應性Pluronic F-127(PL)-殼聚糖水凝膠中，方法簡單且經濟可行。通過掃描電子顯微鏡、流變學和差示掃描量熱法對該水凝膠進行表征。結果表明，該水凝膠具有光滑的表面、熱響應行為和良好的機械穩定性。含有GSNO的PL/CS水凝膠在NO釋放和GSNO擴散的動力學實驗證明，在適合生物醫學應用的濃度下持續釋放NO/GSNO，并且未發現釋放NO的水凝膠在具有抗菌作用的濃度范圍對Vero哺乳動物細胞有毒。因此，GSNO-PL/CS水凝膠是局部遞送NO的合適生物材料，可用于傷口愈合、抗菌等方面。

堿性化學灼傷可引起角膜的氧化損傷，這可能導致視力喪失或失明。Tsai等[35]研究表明，外源性天然抗氧化劑可能是角膜傷口愈合的潛在治療方法，然而，眼部生物利用度低和停留時間短是局部施用抗氧化劑的限制因素。阿魏酸(FA)是一種天然酚類化合物，是一種極好的抗氧化劑。他們研究FA在氧化應激下角膜上皮細胞(CECs)中的作用，并評價使用含有FA的熱敏殼聚糖水凝膠進行角膜傷口愈合的可行性。結果表明，含有FA的水凝膠可以降低CECs的炎癥水平和細胞凋亡。在兔角膜堿燒傷模型中，加載FA的水凝膠可促進角膜傷口愈合。由此表明，負載FA的水凝膠可能在治療角膜堿燒傷中具有潛在的應用價值。

4 總結與展望

隨著醫療服務水平的提高，人們對創傷修復敷料的要求也越來越高。水凝膠獨特的生物化學性質和三維網絡結構為生物醫學領域提供了廣泛的應用，包括局部藥物輸送、組織工程、藥物緩釋等。殼聚糖因具有創傷修復、止血、抑菌等性能而使殼聚糖基水凝膠成為研究的一個熱點，但是CS水凝膠的成膠時間、機械性能、藥物釋放等還很難進行精準控制，從而達到實際滿足人體需要的智能水平。因此，進一步提升水凝膠的相關性能，實現相對精準的控制，是今后研究的方向。同時，殼聚糖基水凝膠大多數基于膠原蛋白、納米纖維、多肽等用于控制釋放或細胞增殖、分化而開發的，其顯示出作為藥物基質的巨大潛力，有待進一步的去研究與開發。