滅菌方法和培養基質對沙氏鹿茸草種子發芽的影響

郎曉平，孫健，沈曉霞，江建銘，王志安

(1.浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310053； 2.浙江省中藥研究所有限公司，浙江 杭州 310023)

沙氏鹿茸草(MonochasmasavatieriFranch.)為玄參科鹿茸草屬多年生草本植物，廣泛分布于我國華南地區的浙江、江西、湖南、貴州等省份。全草入藥，具有清熱解毒之功效，常用于感冒、咳嗽、赤痢、便血、風濕骨痛、牙痛和乳癰等癥的治療，收錄于浙江省炮制規范。目前，有關研究主要集中于沙氏鹿茸草的有效成分分析[1-3]、種子的去休眠[4]、組培苗的愈傷誘導與培養[5-6]等方面。沙氏鹿茸草的組培滅菌方法主要為消毒液滅菌，如用升汞、NaClO溶液和乙醇處理蒴果。然而，成熟的沙氏鹿茸草蒴果容易開裂，即使未開裂的蒴果經4 ℃儲藏1個月后變得脆而硬，后續的接種操作困難，因此，探索了剝離種子氣體滅菌的方法。愈傷組織誘導和組培苗培養是優異沙氏鹿茸草種苗快速繁育的重要手段，已有的研究均以成熟植株營養體器官誘導愈傷組織，存在污染率高、成活率低、愈傷組織誘導率低等問題，為此，作者探索了無菌種苗的組培條件，以便為后續的幼苗愈傷組織的誘導提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

未完全成熟的沙氏鹿茸草種子，2017年6月19日采集于浙江省麗水市縉云縣的同一自然群體，并于4 ℃冰箱保存。

1.2 處理設計

1.2.1 氣體滅菌

將沙氏鹿茸草的蒴果剪開，剝離蒴果內種子。種子用濾紙包裹，置于5 L密封皿中，取5%NaClO溶液80 mL于100 mL燒杯中，加入3 mL濃鹽酸，分別處理1、2、3和4 h。處理后的種子，接種于含有20 g·L-1蔗糖的1/2MS培養基上，每瓶接種20粒種子，于25 ℃、光照強度1 500～2 000 lx、光照12 h的條件下培養。接種后21 d統計沙氏鹿茸草種子的萌發和染菌情況。

1.2.2 基質設置

設置7種培養基組別(表1)進行試驗。氯氣滅菌3 h，接種后至28 d記錄不同培養基上沙氏鹿茸草種子的萌發和染菌情況。

1.2.3 抑菌劑處理

選取腈菌唑為沙氏鹿茸草的抑菌劑，以控制接種染菌率，同時考查不同濃度腈菌唑對沙氏鹿茸草種子萌發與生長的影響。在20 g·L-1蔗糖的1/2MS基礎培養基上添加25%的腈菌唑，最終濃度分別為0(CK)、50(A)、100(B)、200(C)、300 μL·L-1(D)，氯氣滅菌3 h后接種，接種后的18和23 d觀察種子的發芽率與污染率，其他試驗方法同1.2.1節。

1.3 統計與分析

污染率=污染瓶數/總瓶數×100%；發芽率為隨機選取12瓶未污染的組培瓶，統計發芽率和相關性狀。使用SPSS 18.0軟件(IBM，USA)對數據進行單因素方差分析，處理間差異性分析使用最小顯著差數法(LSD)，P≤0.05為顯著水平。

表1 不同培養基組別的組成

2 結果與分析

2.1 氯氣滅菌體系優化

表2所示，隨著氯氣處理時間的延長，沙氏鹿茸草種子的組培污染率明顯降低，處理3 h污染率下降至15.0%。隨氯氣處理時間加長，沙氏鹿茸草發芽率呈現明顯下降趨勢，處理間差異顯著，說明氯氣對沙氏鹿茸草種子具有一定毒害作用。本試驗體系下，氯氣處理3 h是較優的滅菌方案，具有較高的發芽率，并且可以較好地控制污染率。

表2 不同氯氣處理時間的種子發芽率和污染率

注：同列無相同小寫字母表示處理間差異顯著(P≤0.05)。表3～5同。

2.2 基質對沙氏鹿茸草種子發芽的影響

接種后3～7 d，染菌現象開始出現，7 d后染菌現象不再增加。土壤基質經過滅菌后仍然具有較高的污染率(表3)，該現象可能與土壤基質富含有機質、滅菌不徹底有關。接種后12 d，Z1、Z2、Z3、Z1、Z2組均萌發長出2片幼葉，而CK與S組萌發較慢，多數種子僅種皮開裂，未長出綠色葉片。接種后14 d，各組處理多數種子萌發，并長出1條主根及2片嫩綠色葉片，苗高2.8～4.9 mm(表4)，根長2～4 mm，S組種子萌發較少，未萌發的種子多數有發芽跡象。接種后21 d，各組種子均完成萌發，開始進入生長階段，未萌發的種子無萌發跡象，不會再萌發。接種后28 d，已萌發的種子開始長出4片綠葉，葉片顏色加深，形狀變大且更為細長，苗高7.4～12.5 mm。

表3 不同培養基組別的種子發芽特征

從表3看出，CK、T1、S組的發芽率顯著低于Z1、Z2、Z3、T2的發芽率，其中S組(土壤處理)發芽率最低。Z3與T2的發芽率較高，而T2、Z1、Z2、Z3之間發芽率無顯著差異，初步證明蔗糖對沙氏鹿茸草的萌發有一定的促進作用，活性炭不影響種子萌發。當蔗糖濃度達到30 g·L-1，污染率呈現降低趨勢，同時，活性炭能在一定程度上減少培養基的污染。由表4可知，土壤組生長最為緩慢，加入蔗糖的Z1、Z2、Z3、T2組生長顯著快于CK、T1、S組，T2組幼苗顯著高于其他處理。

表4 不同培養基組別的幼苗發育特征

2.3 抑菌劑對沙氏鹿茸草種子發芽的影響

分別在接種后18與23 d觀察沙氏鹿茸草種子的發芽率與污染率，結果(表5)2個時間點污染率沒有變化。

從表5可知，隨著腈菌唑濃度的增加，沙氏鹿茸草的發芽率有下降的趨勢，CK組的發芽率為66.0%。未加腈菌唑組多數在12～14 d發芽，而加入腈菌唑后發芽時間明顯推遲，尤其是腈菌唑濃度為300 μL·L-1的D組，發芽時間推遲到接種后20 d 左右，說明腈菌唑對于沙氏鹿茸草的萌發有抑制作用。腈菌唑的添加使得鹿茸草的染菌情況有所抑制，污染率隨腈菌唑濃度的上升而下降，兩者呈負相關，但其抑菌效果并不突出，與對照組無顯著差異。從苗高的數據可以看出，腈菌唑處理對幼苗生長有明顯抑制作用，表現為生長受抑制，苗高顯著降低，且葉片變小、顏色加深。因此，培養基中添加腈菌唑不能起到顯著的抑菌作用，反而會抑制種子的萌發和幼苗的生長。

表5 不同濃度腈菌唑處理組別的種子發芽率和污染率

3 小結與討論

為防止沙氏鹿茸草蒴果成熟后開裂，供試種子在未完全成熟時采收，會存在部分未成熟種子，因此沙氏鹿茸草的種子發芽率在80%左右。目前，外植體和種子滅菌方法主要是液體滅菌和氣體滅菌，具體包括升汞、次氯酸鈉和氯氣處理等。已有研究表明，氯氣滅菌對種子的毒害作用較小[7]。本試驗體系下，氯氣滅菌后發芽率下降至60%～70%，可以滿足后續試驗需求。沙氏鹿茸草發芽培養基質的研究表明，蔗糖和MS培養基中的營養物質有利于種子的萌發和生長[8]，且20 g·L-1以上的蔗糖濃度才能保證沙氏鹿茸草的快速生長。腈菌唑是廣譜殺菌劑，熱穩定性較好，可以抑制真菌麥角甾醇的生物合成，農業生產中對子囊菌、擔子菌等均具有較好的防治效果，常用于種子包衣劑[9]。本試驗中，高濃度的腈菌唑對于沙氏鹿茸草幼苗表現出明顯的毒害作用，300 μL·L-1處理的污染率為13.3%。一方面，一個組培瓶中只要有一粒種子滅菌不完全就會導致真菌或細菌污染；另一方面，該現象可能是由無法徹底滅菌的種子內生菌引起[10]，長勢強壯的T2和Z3組具有較低的污染率可以間接證明這一推測[11]。綜上所述，經過氯氣滅菌3 h后，20 g·L-1蔗糖的1/2MS培養基可以滿足沙氏鹿茸草的萌發和生長需求。