MDCK單克隆細胞的制備方法研究

張松，張麗，喬自林，王家敏，馬桂蘭，侯蘭新*

(1.西北民族大學生物醫學研究中心 甘肅省動物細胞工程技術創新中心，甘肅 蘭州 730030； 2.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030； 3.蘭州民海生物工程有限公司，甘肅 蘭州 730010)

MDCK細胞系(Madin-Darby canine kidney cells，MDCK)是從母曲架犬腎組織中分離培養而獲得的上皮樣貼壁細胞，該細胞系可連續傳代[1]。MDCK細胞對各種流感病毒均較為敏感，已廣泛應用于流感病毒的感染和檢測等領域[2]。人流感病毒主要通過與MDCK細胞上的受體結合感染細胞，但細胞表面的流感病毒受體的類型和數量存在著個體差異[3]，流感病毒在同種細胞不同個體的細胞內復制效率也存在高低差異。因此，通過有限稀釋法制備MDCK單克隆細胞庫，為篩選工作提供實驗細胞基礎顯得尤為重要。流感全稱為流行性感冒，是由流感病毒引起的一種呼吸道疾病[4]。流感病毒感染是由其表面的血凝素蛋白(HA蛋白)與宿主細胞膜表面上的糖鏈受體唾液酸(sialic acid，SA)共同介導而完成的，人流感病毒HA蛋白主要識別末端為唾液酸-α-2,6-半乳糖(SA-α-2,6-Gal)的糖鏈受體，其存在于人呼吸道上皮細胞表面[5]。接種流感疫苗被認為是預防流感發生和流行的有效手段[6]。生產流感疫苗的傳統手段是利用雞胚培養系統，由于使用雞胚培養流感病毒常常會導致外源性污染、病毒變異、不同培養批次的流感病毒滴度不一致，因而難以迅速應對流感大流行[7-8]。因此，急需開發一種可以大規模生產流感疫苗的理想的方法。采用大規模細胞培養技術與流感病毒的生產結合被認為是最具潛力的發展方向[9]。本研究擬采用有限稀釋法探索MDCK單克隆細胞株的最優制備條件，提高MDCK單克隆細胞株的制備效率，為流感病毒的后續研究提供細胞資源和有價值的參考依據。

1 材料與方法

1.1 MDCK細胞系

MDCK細胞系購自ATCC(CCL-34)，由甘肅省動物細胞工程中心于-198 ℃液氮罐保存。

1.2 主要試劑

胎牛血清和新生牛血清均購自蘭州民海生物工程有限公司；DMEM培養基和0.25%胰酶均購自蘭州百靈生物技術有限公司；配制PBS(無Ca2+、Mg2+)緩沖液。

1.3 主要儀器設備

CO2細胞恒溫培養箱(上海博訊公司)，生物倒置顯微鏡(日本奧林巴斯光學科技有限公司)，Countstar自動細胞計數儀(上海睿鈺生物科技有限公司)等。

1.4 細胞培養

將儲存于液氮罐中的MDCK工作庫細胞取出，37 ℃水快速融化后置于50 cm2培養瓶中，補加培養基后再置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養。待MDCK細胞生長至致密單層時，PBS液清洗，倒出PBS后加入5 mL 0.25%胰酶，緩慢搖動細胞培養瓶使胰酶充分沒過細胞表面，將細胞放回培養箱內繼續消化5 min，取出在顯微鏡下觀察。當細胞全部變圓開始脫落時棄去胰酶，并在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中繼續放置3 min，取出倒去胰酶加入15 mL DMEM培養基，將細胞吹打混勻后按1∶4比例傳代，繼續將細胞放入37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。

1.5 數據處理

試驗所獲數據采用SPSS 21.0軟件中的單因素方差分析和LSD法多重比較。

2 結果與分析

2.1 血清類型對制備MDCK單克隆細胞的影響

血清類型是影響制備MDCK單克隆細胞數的主要因素，胎牛血清制備的單克隆細胞數為(9.50±0.19)，明顯高于新生牛血清(5.25±0.56)。

2.2 血清類型對MDCK單克隆細胞株狀態對比

觀察MDCK單克隆細胞在胎牛血清和新生牛血清中的生長形態，不同血清培養的MDCK單克隆細胞在形態和生長特性方面沒有很大差異，均呈典型多角上皮樣形態(圖1)。但細胞在不同的血清培養條件下生長狀態不同，胎牛血清培養的細胞生長速度較新生牛血清快。同傳代比例生長48 h，胎牛血清培養的MDCK細胞匯合度可以達到95%，而新生牛血清培養的MDCK細胞匯合度只有80%。表明胎牛血清在MDCK細胞的體外增殖過程中，可使細胞增殖更加活躍。胎牛血清培養的MDCK單克隆細胞，長滿單層后均勻分布，細胞胞質豐滿，核仁清晰。新生牛培養上清液較胎牛血清上清液渾濁，細胞上清液中細胞出現脫壁現象，死亡細胞增多。因此，用胎牛血清制備的MDCK單克隆細胞生長狀態更好。

圖1 胎牛血清與新生牛血清制備MDCK單克隆細胞株狀態對比

2.3 胎牛血清濃度對制備MDCK單克隆細胞的影響

胎牛血清濃度和單孔理論接種密度是影響有限稀釋法制備MDCK單克隆細胞效率的主要因素。實驗結果表明，15%胎牛血清的單克隆細胞數為(7.38±0.65)，高于10%胎牛血清的單克隆細胞數(5.75±0.65)，有助于制備更多的MDCK單克隆細胞；單孔理論細胞密度值為1個·孔-1時，制備的MDCK單克隆細胞數為(9.50±0.19)，極顯著高于0.5個·孔-1(8.00±0.01)和2個·孔-1(3.50±0.57)2個密度(P<0.01)。

3 討論

流感對人類健康威脅嚴重，其發病率為各種傳染性疾病之首，是嚴重危害人類健康的重要傳染病之一。據世界衛生組織報告，全球每年約有6億～l2億人感染流感，其中死亡人數高達50萬～100萬人，給人類健康和經濟造成了巨大危害和損失。特別是近年來人感染高致病性H5N1禽流感，以及2009年在墨西哥暴發的甲型H1N1流感，再一次給人們敲響了警鐘，人類流感的防控極為重要。流感病毒表面抗原時常發生變異[11]，及時接種疫苗是預防流感最有效的方法。目前，流感疫苗的主要生產介質是雞胚，然而由雞胚來源的疫苗存在著質量難以控制、生產周期長、易引起過敏等問題，一旦流感暴發，其來源將成為瓶頸，無法及時應對流感疫情。因此，開發新的人用流感疫苗生產介質已成為疫苗生產的關鍵，世界衛生組織(World Health Organization，WHO)推薦細胞是生產疫苗的優良介質。MDCK細胞系是1958年Madin等從美國一頭Cocker Spanie母曲架犬的腎臟組織中分離培養建立得到的細胞[12]。該細胞形態呈上皮細胞樣，貼壁生長，可連續傳代，具有易培養、增殖快、流感病毒感染效率高等特點，被用作流感病毒疫苗生產的重要細胞系。

牛血清是生物醫藥領域公認的培養細胞的一種重要原料，含有豐富的細胞生長必需的營養成分，如蛋白質、激素、生長因子、貼壁因子和多肽類物質等[13-14]，支撐著細胞的生長和正常增殖，為順利進行細胞體外培養提供了必要的營養保障[15-16]。我國使用最多的是胎牛血清和新生牛血清，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)是在屠宰懷孕母牛的時候，通過心臟穿刺采血獲取的胎牛血清；新生牛血清(newborn bovine serum，NBS)是指出生14 h內未進食的健康新生牛采集分離的血清原料進一步精制而成[17]。胎牛血清絕大部分的物質來源于母體,含有豐富的胚胎發育過程中必需的一些生長因子和激素等；新生牛血清的這些成分相對較少，隨著犢牛月齡的增長,血清中的抗體、補體等成分增加，而這些大分子蛋白質是一種異源物質，給細胞增殖帶來不利影響。大量的脂蛋白、纖維蛋白以及多肽類物質在低溫保存解凍過程中會自然形成很多沉淀。有限稀釋法是一種單細胞培養技術，通過將細胞稀釋至每孔只有單個細胞后進行培養而獲得單克隆化細胞株的目的。該方法適用于細胞純化，突變細胞株的選擇和分離，是培養單克隆細胞株的常用方法[10]。一個細胞克隆株中的所有細胞均來源于同一個祖先細胞，故稱之為單克隆細胞(monoclonal cell)。本研究中新生牛血清培養的MDCK細胞中發現有少量的雜質懸浮于細胞液中，細胞貼壁后雜質便貼附于細胞上，影響細胞的生長和單細胞孔的標記。馬桂蘭等[18]研究發現，在培養單克隆細胞時，細胞失去了群體效應支持，生長變得艱難，使用胎牛血清的效果比新生牛的更好。血清的質量直接關系到研究進度和生產效益，血清選擇不當可能會造成細胞增殖緩慢甚至導致細胞不增殖，推遲科研進度，導致不必要的損失。因此，研究不同血清對有限稀釋法制備單克隆細胞的影響具有很重要的意義。本研究血清對比結果顯示，使用胎牛血清制備MDCK單克隆細胞對細胞生長狀態、生長速度及單細胞孔的標記角度更加理想。

細胞培養中使用的血清濃度一般為0.5%～30%[19]。血清濃度過高會導致細胞生長過快，相悖于MDCK細胞的正常生長周期；濃度過低會導致細胞生長過慢甚至死亡[20]。馬萍等[21]研究表明胎牛血清含量為5%～15%時，MDCK細胞形態正常，細胞均能長成片。MDCK細胞在不同濃度的胎牛血清下生長趨勢也有很大不同。本研究顯示，MDCK細胞在低濃度血清培養條件下生長狀態不佳。因此，設定10%和15% 2個胎牛血清濃度，探究其與制備MDCK單克隆細胞效率的相關性，結果表明血清濃度與制備MDCK單克隆細胞效率二者之間高度相關，有限稀釋法利用15%胎牛血清濃度制備MDCK時效率明顯提升。單孔細胞濃度是影響有限稀釋法制備MDCK單克隆細胞株的重要因素。隨著單孔細胞濃度的升高，MDCK單克隆細胞制備效率呈現先上升后快速下降的趨勢。本研究結果顯示，單孔細胞濃度與制備單克隆細胞數目有正相關性，在1個·孔-1時，通過有限稀釋法制備的單克隆細胞數目最多，相比另外兩濃度具有明顯優勢。與2個·孔-1的單孔細胞濃度相比，0.5個·孔-1單孔細胞濃度時制備MDCK單克隆細胞株在單孔標記操作更加簡單快速，省時節力。

隨著利用細胞大規模培養技術生產流感疫苗的研究熱度越來越高，高效制備MDCK單克隆細胞株也逐漸成為研究重點，可相關實驗參數條件均處于探索階段。本研究采用有限稀釋法制備MDCK單克隆細胞株，胎牛血清濃度為15%，96孔細胞培養板單孔接種密度為1個·孔-1時，可以較高效制備MDCK單克隆細胞株。本研究建立的MDCK單克隆細胞庫為開展MDCK細胞及流感細胞基質疫苗的研究提供了細胞資源，探究了有限稀釋法制備MDCK單克隆細胞的實驗參數條件，可為今后制備單克隆細胞并開展流感疫苗相關研究提供基礎理論依據。