ELISA法在檢測HIV抗體中的影響因素

石 楠

（朝陽市中心血站檢驗(yàn)科，遼寧 朝陽 122000）

ELISA法的優(yōu)勢是便捷操作、高靈敏度與特異性，可以檢測各類抗原與抗體，它是普適的固相免疫檢測法[1]。艾滋病正呈不斷蔓延的態(tài)勢，就更加應(yīng)當(dāng)重視艾滋病檢測的準(zhǔn)確度。本次實(shí)驗(yàn)選擇2016年12月至2018年12月3860例患者作為本次實(shí)驗(yàn)的研究對象，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2016年12月至2018年12月3860例患者作為本次實(shí)驗(yàn)的研究對象,所有患者接受常規(guī)檢查與抽血檢查,進(jìn)行抽血檢查時，務(wù)必嚴(yán)格遵照安全防護(hù)制度與臨床采血技術(shù)要求，并按照試劑盒說明書規(guī)定，實(shí)施血液樣本采集。所有患者的靜脈血采集量為3～5 mL。

1.2 試劑與設(shè)備。試劑：試劑經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)，批檢合格，全部處在有效期內(nèi)。運(yùn)輸與貯存試劑時，應(yīng)保持在2～8 ℃環(huán)境中，忌在常溫下存放試劑過長時間，試劑盡量不要多次凍融或受熱，否則致酶失活，運(yùn)用當(dāng)中應(yīng)當(dāng)密閉保存防止受潮。實(shí)驗(yàn)開始前，把試劑放到室溫下大約0.5 h，讓試劑與室溫趨于一致，從而以最快速度達(dá)到實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。儀器：全自動酶免分析儀。

表1 不同年齡組HIV抗體檢測情況

1.3 檢測方法：如果無法立刻檢測標(biāo)本，把在5 d內(nèi)檢測的血清標(biāo)本保存在4 ℃的環(huán)境中，把1周后檢測的血清標(biāo)本保存在低溫的環(huán)境中。嚴(yán)格遵照試劑使用說明書、檢測規(guī)程，對血清標(biāo)本進(jìn)行檢測，避免交叉污染。數(shù)次檢測，處理檢測結(jié)果，建立質(zhì)控圖。經(jīng)過檢測，結(jié)果呈陰性，出具HIV抗體陰性報告。檢測結(jié)果呈陽性，將陽性人員送至省疾控中心，以待進(jìn)一步確認(rèn)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理：此次實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)全部由SPSS21.0版統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，計量資料采用±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間數(shù)據(jù)對比；以率（%）表示計數(shù)資料，采用卡方檢驗(yàn)比較組間資料。以P＜0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

檢測3860例患者HIV抗體，10例確認(rèn)為陽性，陽性率為0.26%。10例陽性確診病例中，男性7例，女性3例，年齡20～46歲，見表1。

3 討論

3.1 ELISA法：ELISA法就是酶聯(lián)免疫吸附測定法，經(jīng)免疫酶技術(shù)演化而來的特殊試劑分析法，檢測當(dāng)中，注入特殊的酶底物，經(jīng)酶的催化或水解，無色的底物就會呈現(xiàn)出顏色；因而，通過肉眼或依靠分光光度計，即可觀測檢測結(jié)果[2]。

3.2 ELISA法檢測HIV抗體的影響因素

3.2.1 樣本因素。運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附測定法進(jìn)行檢測時，HIV病毒抗體標(biāo)本自身的質(zhì)量會對檢測產(chǎn)生重大影響。臨床醫(yī)學(xué)常規(guī)血檢標(biāo)本就是通常的血清，檢驗(yàn)血清時，需要徹底分離，攝入纖維蛋白會產(chǎn)生一定的反應(yīng)孔。出現(xiàn)上述情況的原因在于纖維蛋白本身有著吸附功效，檢測時難以清除干凈，從而檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性受到一定影響；其次，在冷凍保存血清樣本時，切忌反復(fù)冷處理血清樣本，因?yàn)槊窟M(jìn)行一次冷處理都會破壞血清蛋白分子；與此同時，催化處理溶血標(biāo)本中產(chǎn)生的紅血蛋白，以防止二次洗板當(dāng)中，殘留存活的蛋白給檢測結(jié)果的正確反應(yīng)帶去影響[3]。

3.2.2 加樣因素。運(yùn)用ELISA法檢測HIV抗體時，加樣的操作人員會直接影響檢測質(zhì)量，因此，務(wù)必重視控制此過程的質(zhì)量。通常選擇移液器進(jìn)行加樣，定時校準(zhǔn)移液器，操作人員應(yīng)當(dāng)對加樣時間加以控制，保證在短期內(nèi)完成，但是若加樣量過大，就應(yīng)當(dāng)分批次操作，并掌握好每批次間的實(shí)施時間，防止產(chǎn)生相互干擾現(xiàn)象。加樣時，提前搖勻滴瓶，接著進(jìn)行預(yù)吸，在擠出第1滴后，再增加滴數(shù)，旨在避免產(chǎn)生氣泡。嚴(yán)格把握滴入量，以保證酶標(biāo)板孔底部的滴入量達(dá)到要求，防止接觸孔壁的邊緣，也就是操作人員選擇垂直加樣的方法，可以較好防止加樣對檢測結(jié)果準(zhǔn)確度所帶去的影響[4]。

3.2.3 溫度控制因素。相關(guān)實(shí)踐研究證明，ELISA法檢測HIV抗體時，溫度成為致檢測結(jié)果呈現(xiàn)假陽性或假陰性的主要因素，所以操作人員一定要對溫度進(jìn)行嚴(yán)格控制。首先，應(yīng)當(dāng)關(guān)注冰箱溫度與實(shí)際溫度的不同，在冰箱中放入溫度計，以監(jiān)測樣本與試劑盒所處環(huán)境的溫度情況，并記錄相關(guān)情況。把樣本與試劑盒從冰箱內(nèi)取出后，需將其于室溫中放置一段時間，當(dāng)樣本與試劑盒的溫度與室溫達(dá)到一致后，再行開始操作。沒有用完的試劑，依舊密閉保存，并清楚標(biāo)注其實(shí)際情況。在操作開始之前，調(diào)整室溫溫度到20～25 ℃。溫度會影響抗原、抗體結(jié)合，顯色深度會隨著溫度的上升而加深，所以應(yīng)當(dāng)控制顯色過程中的溫度。比如：把辣根過氧化物酶（HRP）當(dāng)作標(biāo)記酶物，一般底物是3，3～5，5～-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），務(wù)必溫度要控制在（37±1）℃，且此溫度要保持30 min，方可產(chǎn)生催化反應(yīng)。另外，如果希望弱陽性標(biāo)本孔可以充分顯色，務(wù)必要把溫度控制在37 ℃以下，且維持30 min后終止反應(yīng)，防止時間過長，影響繪制質(zhì)控圖。

3.2.4 洗板因素。如果進(jìn)行機(jī)洗，就要注意清潔與維護(hù)儀器，適時檢測，保證洗板質(zhì)量。使用后，務(wù)必使用蒸餾水沖洗管道，一方面清潔管道，另一方面防止污染環(huán)境[5]。洗板過程中，防止混用洗滌液，以免不同試劑采用對應(yīng)洗滌液。通常清洗洗板次數(shù)為5～6次，清洗時間需控制在60 s以內(nèi)，從而可以防止假陽性應(yīng)對浸泡板子。

3.2.5 比色因素。進(jìn)行比色時，挑選雙波長。微孔板與孔內(nèi)標(biāo)本具有非特異性吸收、灰塵的功能，會對吸光度產(chǎn)生一定影響，雙波長就能較好防止此種影響[6]。

3.2.6 讀板因素。在讀板過程中，打開酶標(biāo)儀，至少預(yù)熱20 min，接著方可測定樣本吸光度，且須控制在15 min內(nèi)讀完。

HIV病毒是艾滋病的主要誘發(fā)因素，所以臨床十分重視監(jiān)測HIV病毒。伴隨醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，目前臨床檢測HIV病毒方法有了長足發(fā)展，這其中被廣泛應(yīng)用且有著頗高價值的檢測方法就是酶聯(lián)免疫吸附劑測定法（ELISA），ELISA可以檢測HIV抗體，從而讓診斷、監(jiān)測艾滋病的功效大大提升。

酶聯(lián)免疫吸附劑測定法（ELISA）是一種特異性基因工程檢測技術(shù)，是檢測HIV較為理想的手段。ELISA法檢測操作便捷，成本不高，有著很高的特異性與靈敏度，同時可以實(shí)現(xiàn)自動化操作，十分有利于把控實(shí)驗(yàn)室檢測質(zhì)量，檢測結(jié)果準(zhǔn)確度高，其檢測結(jié)果數(shù)據(jù)也利于保存，正是因?yàn)橛兄鲜鲞@些優(yōu)勢，ELISA法被廣泛運(yùn)用到醫(yī)院大批量體檢、篩查血站獻(xiàn)血人員、中型醫(yī)院檢測科早期檢測HIV抗體，從而減少假陽性率，降低醫(yī)患糾紛的概率[7]。與此同時，其他比如：監(jiān)測艾滋病流行病學(xué)，檢測特定人群HIV感染情況與發(fā)展趨勢，針對流行病學(xué)、臨床、病毒學(xué)或HIV相關(guān)研究對象開展自愿檢測等，應(yīng)當(dāng)挑選具有高特異性的ELISA試劑。

綜上所述，運(yùn)用ELISA法檢測HIV抗體時，應(yīng)當(dāng)分析影響ELISA法檢測抗體結(jié)果的因素，挑選優(yōu)質(zhì)試劑，確保檢測操作規(guī)范，從而保證最后檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度，讓真陽性率能夠進(jìn)一步提高。