穿心蓮內(nèi)酯對(duì)人肝癌細(xì)胞MHCC97H增殖的影響及其機(jī)制研究

劉紅英， 王協(xié)奇， 袁麗娜， 劉影， 彭燕， 羅碧怡， 何青蓮

（1.廣東省中醫(yī)院病理科，廣東廣州 510120；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510006）

肝細(xì)胞癌（HCC）是最常見的惡性腫瘤之一[1]。目前臨床上針對(duì)HCC的西醫(yī)治療方法主要有放療、化療、介入治療、手術(shù)切除、肝移植等。其中，手術(shù)切除和肝移植被認(rèn)為是最有效的治療方法，但在臨床上只有15%的患者符合肝切除及肝移植的條件[2]；而傳統(tǒng)的化療常因出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性導(dǎo)致HCC療效不佳[3]。因此，尋找安全有效的治療HCC的方法對(duì)改善肝癌患者生活質(zhì)量具有重要的臨床意義。近年來，從中藥中尋找生物活性成分應(yīng)用于腫瘤治療備受廣泛關(guān)注。

穿心蓮，味苦性寒，歸肺、胃、大腸和小腸經(jīng)，具清熱解毒燥濕之功。穿心蓮內(nèi)酯（andrographolide，Andro）是藥用植物穿心蓮的主要有效成分之一[4]，為二環(huán)雙萜內(nèi)酯類化合物。Andro具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等藥理學(xué)作用[5，6]。文獻(xiàn)報(bào)道，Andro 對(duì)結(jié)腸癌[7]、乳腺癌[8]、非小細(xì)胞肺癌[9]、胰腺癌[10]、黑色素瘤[11]等有很強(qiáng)的抗腫瘤作用，其抗腫瘤機(jī)制與細(xì)胞周期阻滯[12]、誘導(dǎo)凋亡與自噬[13]、抗血管新生[14]、抑制腫瘤細(xì)胞遷移、增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性[7，9]等有關(guān)。基于此，本研究以人肝癌細(xì)胞MHCC97H為體外細(xì)胞模型，觀察Andro對(duì)MHCC97H細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制，探討其體外抗肝癌作用，為其臨床應(yīng)用于HCC的治療提供理論基礎(chǔ)。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑Andro（美國Sigma公司，批號(hào)：365645）。四甲基偶氮唑鹽（MTT）（美國Sigma公司）；RPMI 1640（美國Gibco公司）；Bax（美國Abcam公司）；Bcl-2、裂解型胱天蛋白酶3（cleaved-caspase-3）、周期素B1（cyclin B1）、周期素依賴性激酶1（CDK1）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p-mTOR（Ser2448）、p70核糖體S6蛋白激酶（p70S6K）、p-p70S6K（Thr389）、β-actin（美國Cell Signaling Technology公司）；剪切型聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（cleaved-PARP）（美國eBioscience公司）；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒、細(xì)胞周期分析試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）。

1.2主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；BioTekELx800TM通用酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）；CytomicsTMFC 500流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司）；Molecular Imager Chemi Doc XRS成像儀（美國Bio-Rad公司）；TE2000-U倒置相差熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖以每孔5 000個(gè)細(xì)胞量將MHCC97H細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，按實(shí)驗(yàn)要求加入終濃度（物質(zhì)的量濃度）為5、10、20、30、40、50 μmol/L的Andro[Andro粉末先用DMSO溶解，再用培養(yǎng)基稀釋至細(xì)胞處理濃度，控制DMSO的含量為0.1%（v/v）]，并設(shè)立溶劑對(duì)照組（僅用0.1%DMSO溶劑）以及空白孔。每組設(shè)5個(gè)平行孔。于24、48、72 h檢測(cè)不同濃度的Andro對(duì)MHCC97H細(xì)胞的增殖作用，檢測(cè)時(shí)每孔加入MTT（5 mg/mL）工作液20 μL，37 ℃孵育4 h后，棄培養(yǎng)基，加入DMSO溶解，并通過酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度[D（λ）]。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。計(jì)算MHCC97H細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率（p）=[Andro組D（λ）值-空白組D（λ）值]/[對(duì)照組D（λ）值-空白組D（λ）值]×100%。

1.4 Annexin V-PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡將細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL的MHCC97H細(xì)胞接種于6孔板中，貼壁后，用25、50 μmol/L Andro分別處理細(xì)胞12、24、48 h。同時(shí)設(shè)立溶劑對(duì)照組（僅用0.1%DMSO溶劑）。收集細(xì)胞后，用冷PBS洗細(xì)胞2次，并用binding buffer重懸。加入AnnexinV-FITC及碘化丙啶（PI）試劑，在暗處孵育5 min后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5 Hoechst 33342染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡將細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL的MHCC97H細(xì)胞接種于12孔板中，貼壁后，用25、50 μmol/L Andro處理細(xì)胞48 h，同時(shí)設(shè)立溶劑對(duì)照組（僅用0.1%DMSO溶劑）。加入10 μL Hoechst 33342（5 mg/mL）染液，10 min后，細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2次后，在熒光顯微鏡下觀察，拍照。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期取細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL的MHCC97H細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁并饑餓處理12 h后，實(shí)驗(yàn)組加入25、50 μmol/L Andro，同時(shí)設(shè)立溶劑對(duì)照組（僅用0.1%DMSO溶劑）。培養(yǎng)12、24、48 h后，收集所有細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄去上清后，用PBS溶液清洗1次，用200 μL PBS重懸細(xì)胞后，加入體積分?jǐn)?shù)75%冰乙醇5 mL混勻固定，4℃固定12 h。檢測(cè)前，將細(xì)胞離心后棄乙醇，用PBS清洗1次，用binding buffer輕輕重懸后，加入PI試劑，室溫避光孵育15 min后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.7蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL的MHCC97H細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入50 μmol/L Andro，同時(shí)設(shè)立溶劑對(duì)照組（僅用0.1%DMSO溶劑）。處理48 h后，棄培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗3次，加入適量的含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，然后以4℃、15 000×g離心10 min，收集上清液。用BCA法精確測(cè)量蛋白質(zhì)含量后，應(yīng)用十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）后轉(zhuǎn)膜。膜在50 g/L脫脂牛奶室溫?fù)u床孵育1 h，TBST（pH=7.6）清洗3次，5 min/次，分別加入稀釋的Bax（1∶2 000），Bcl-2（1∶1 000），cleaved-caspase-3（1∶1000），cleaved-PARP（1∶1000），cyclin B1（1∶1 000），CDK1（1∶1 000），mTOR（1∶2 000），p-mTOR（1∶2 000），p70S6K（1∶2 000），p-p70S6K（1∶2 000）、β-actin（1∶10 000）抗體，4℃孵育過夜后，TBST清洗3次，5 min/次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，再用TBST清洗3次，5 min/次，ECL法顯色。應(yīng)用Image Lab 5.2.1軟件分析Western blot條帶灰度值，數(shù)據(jù)結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（βactin）灰度值比值（p）表示。

1.8統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPad Prism 5軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，Andro組與對(duì)照組的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IC50值通過量效曲線采用非線性回歸分析計(jì)算得出。

2 結(jié)果

2.1Andro對(duì)MHCC97H細(xì)胞增殖的影響表1結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照組比較，Andro 5、10、20、30、40、50 μmol/L 組 24、48、72 h MHCC97H 細(xì)胞增殖率下降，且隨著Andro物質(zhì)的量濃度、處理時(shí)間的增加而逐漸降低，提示Andro對(duì)MHCC97H細(xì)胞增殖的抑制作用隨著Andro濃度的增加及作用時(shí)間的延長而增強(qiáng)。由非線性回歸分析得到Andro在 24、48、72 h的 IC50值分別為（61.31±4.44）μmol/L、（31.55±3.67）μmol/L、（22.05±3.06）μmol/L。

表1 不同Andro濃度不同處理時(shí)間對(duì)MHCC97H細(xì)胞增殖的影響Table 1 The effect of Andro with different concentrations on the proliferation of MHCC97H cells after treatment for different time （±s）

表1 不同Andro濃度不同處理時(shí)間對(duì)MHCC97H細(xì)胞增殖的影響Table 1 The effect of Andro with different concentrations on the proliferation of MHCC97H cells after treatment for different time （±s）

①P＜0.05，②P＜0.01，③P＜0.001，與溶劑對(duì)照組比較

組別溶劑對(duì)照組Andro 5 μmol/L組Andro 10 μmol/L組Andro 20 μmol/L組Andro 30 μmol/L組Andro 40 μmol/L組Andro 50 μmol/L組細(xì)胞增殖率（p/%）t=72 h 100.0±5.2 95.1±8.0 83.0±2.5②50.5±10.7②34.9±15.1②21.5±4.9③7.1±1.1③t=24 h 100.0±7.2 107.6±18.4 106.8±17.0 94.8±5.0 80.6±5.4②81.1±2.1③68.8±14.8①t=48 h 100.8±11.3 106.9±5.4 91.8±10.5 70.9±9.0②61.2±15.4①46.7±20.4①16.6±5.2③

2.2Andro對(duì)MHCC97H細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照組比較，Andro 25、50 μmol/L組12、24、48 h MHCC97H細(xì)胞凋亡率均升高，呈時(shí)間和劑量依賴性，其中Andro 50 μmol/L組24、48 h MHCC97H細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.001），見圖1。Hoechst 33342染色結(jié)果也顯示，Andro 25、50 μmol/L組48 h細(xì)胞凋亡率較溶劑對(duì)照組顯著升高（P＜0.05）。見圖2。2項(xiàng)研究結(jié)果表明Andro可以促進(jìn)MHCC97H細(xì)胞凋亡，提示Andro對(duì)MHCC97H細(xì)胞增殖的抑制作用可能與其促細(xì)胞凋亡作用有關(guān)。

2.3Andro對(duì)MHCC97H細(xì)胞周期的影響表2、圖3結(jié)果顯示，50 μmol/L Andro作用MHCC97H細(xì)胞48 h后，G2/M期細(xì)胞數(shù)量為（19.9±2.5）%，而溶劑對(duì)照組G2/M期細(xì)胞數(shù)量為（8.0±2.0）%，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.001）。表明Andro可使MHCC97H細(xì)胞阻滯于G2/M期。

2.4Andro對(duì)MHCC97H細(xì)胞凋亡及周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響表3、圖4結(jié)果顯示：（1）凋亡相關(guān)蛋白：與溶劑對(duì)照組比較，Andro 50 μmol/L組中促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-PARP表達(dá)升高（P＜0.05或P＜0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低（P＜0.01）。表明Andro可促進(jìn)MHCC97H細(xì)胞凋亡。（2）周期相關(guān)蛋白：與溶劑對(duì)照組比較，Andro 50 μmol/L組MHCC97H細(xì)胞中周期蛋白cyclin B1和CDK1表達(dá)均下降（P＜0.05），提示Andro可能通過下調(diào)cyclin B1和CDK1的表達(dá)誘導(dǎo)MHCC97H細(xì)胞發(fā)生G2/M期周期阻滯。

圖1 不同Andro濃度不同處理時(shí)間對(duì)MHCC97H細(xì)胞凋亡的影響Figure 1 The effect of Andro with different concentrations on the apoptosis of MHCC97H cells after treatment for different time

圖2 不同濃度Andro處理48 h對(duì)MHCC97H細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 The effect of Andro with different concentrations on the apoptosis of MHCC97H cells after treatment for 48 h

表2 不同濃度Andro不同處理時(shí)間對(duì)MHCC97H細(xì)胞周期的影響Table 2 The effect of Andro with different concentrations on MHCC97H cell cycle after treatment for different time （±s）

表2 不同濃度Andro不同處理時(shí)間對(duì)MHCC97H細(xì)胞周期的影響Table 2 The effect of Andro with different concentrations on MHCC97H cell cycle after treatment for different time （±s）

①P＜0.01，②P＜0.001，與同時(shí)間對(duì)應(yīng)周期溶劑對(duì)照組比較

細(xì)胞數(shù)量（p/%）t=48 h 51.3±6.2 43.0±9.4 8.0±2.0 54.6±4.0 41.6±2.3 5.4±0.3 44.1±1.4 36.1±2.0 19.9±2.5①組別溶劑對(duì)照組Andro 25 μmol/L組Andro 50 μmol/L組細(xì)胞周期G0/G1 S G2/M G0/G1 S G2/M G0/G1 S G2/M t=12 h 44.8±1.9 34.8±4.8 20.3±3.3 44.5±2.7 37.3±3.6 18.2±2.9 38.1±2.1 40.2±4.1 21.7±5.8 t=24 h 64.3±3.7 26.4±4.1 9.2±0.5 62.9±5.3 27.4±3.8 9.7±1.5 48.5±3.4②31.8±3.7 22.4±0.7②

2.5Andro對(duì)MHCC97H細(xì)胞中mTOR信號(hào)通路的影響圖5、表4結(jié)果顯示，Andro 50 μmol/L組mTOR、p70S6K的磷酸化水平較溶劑對(duì)照組下降（P＜0.01或P＜0.001）。

3 討論

肝細(xì)胞癌（HCC）因被發(fā)現(xiàn)被診斷時(shí)就已經(jīng)處于晚期階段，導(dǎo)致高致死率。索拉非尼是美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的治療晚期HCC唯一的藥物，是一種多靶點(diǎn)抑制劑[15]，然而索拉非尼只對(duì)約30%的晚期肝癌患者有益，患者在6個(gè)月內(nèi)往往會(huì)出現(xiàn)獲得性耐藥[16，17]，因此，迫切需要新的有效的治療策略。

中藥提取物在癌癥治療領(lǐng)域占據(jù)著重要的地位，Andro是中藥穿心蓮的主要生物活性成分。本研究結(jié)果顯示，Andro可抑制MHCC97H細(xì)胞的增殖，且呈濃度及時(shí)間依賴性。

圖3Andro對(duì)MHCC97H細(xì)胞周期的影響Figure 3 The effect of Andro on MHCC97H cell cycle

表3 Andro處理MHCC97H細(xì)胞后凋亡及周期相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量Table 3 The relative expression of apoptosis-related proteins and cell-cycle-related proteins in MHCC97H cells treated with Andro （±s，p）

表3 Andro處理MHCC97H細(xì)胞后凋亡及周期相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量Table 3 The relative expression of apoptosis-related proteins and cell-cycle-related proteins in MHCC97H cells treated with Andro （±s，p）

①P＜0.05，②P＜0.01，與溶劑對(duì)照組比較

組別溶劑對(duì)照組Andro 50 μmol/L組cleaved-PARP/β-actin 1.00±0.17 3.43±0.11②Bax/β-actin 1.00±0.09 2.65±0.16②Bcl-2/β-actin 1.00±0.19 0.52±0.19②cleaved-caspase-3/β-actin 1.00±0.12 1.98±0.08①cyclin B1/β-actin 1.00±0.07 0.64±0.13①CDK1/β-actin 1.00±0.11 0.47±0.06①

圖4 凋亡及周期相關(guān)蛋白Western blot電泳條帶Figure 4 The Western blotting electrophoresis results of apoptosis related proteins and cell-cycle-related proteins

圖5mTOR信號(hào)通路蛋白mTOR、p70S6K Western blot電泳條帶Figure 5 The Western blotting electrophoresis results of mTOR signaling pathway proteins mTOR and p70S6K

表4Andro處理MHCC97H細(xì)胞后mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量Table 4 The relative expression of the proteins related with mTOR signaling pathway in MHCC97H cells treated with Andro （±s，p）

表4Andro處理MHCC97H細(xì)胞后mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量Table 4 The relative expression of the proteins related with mTOR signaling pathway in MHCC97H cells treated with Andro （±s，p）

①P＜0.01，②P＜0.001，與溶劑對(duì)照組比較

組別溶劑對(duì)照組Andro 50 μmol/L組p-p70S6K/p70S6K 1.00±0.06 0.35±0.07②p-mTOR/mTOR 1.00±0.09 0.63±0.09①

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在生長發(fā)育過程或者是因?yàn)槟骋恍┮蛩刂械挠绊懀?jīng)過調(diào)節(jié)控制細(xì)胞內(nèi)基因的一種與其產(chǎn)物相聯(lián)的程序性細(xì)胞死亡。越來越多的研究表明細(xì)胞凋亡異常在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要的作用。近年來大量實(shí)驗(yàn)研究表明，線粒體通路在細(xì)胞凋亡機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，在眾多的凋亡調(diào)控基因中，Bcl-2蛋白家族和胱天蛋白酶（caspase）家族目前最受關(guān)注，其中Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中最有代表性的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡基因[18]，caspase-3則是凋亡過程中最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，活化后的caspase-3酶解切割DNA依賴的蛋白激酶（DNA-PK）和聚腺苷二磷酸核糖多聚酶（PARP）等，從而影響DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和損傷修復(fù)[19]。細(xì)胞通過不斷的周期性分裂將自身的遺傳物質(zhì)準(zhǔn)確完整地傳遞給下一代。當(dāng)出現(xiàn)DNA突變后，周期檢查點(diǎn)（cell cycle checkpoint）發(fā)揮作用使細(xì)胞周期停滯，修復(fù)DNA或者直接啟動(dòng)凋亡，如果發(fā)生異變的細(xì)胞存活則會(huì)轉(zhuǎn)化為異常增殖的腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞周期檢查點(diǎn)是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵部位，它決定了DNA復(fù)制及細(xì)胞分裂。由細(xì)胞周期蛋白（cyclin）、細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶（CDK）及其抑制因子（CKI）組成的cyclin-CDK-CKI系統(tǒng)，共同形成了一個(gè)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控的生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)，維持著細(xì)胞進(jìn)行正常的有絲分裂。其中cyclin B/CDK1磷酸化調(diào)節(jié)機(jī)制的缺陷與細(xì)胞分化障礙具有明顯相關(guān)性，而細(xì)胞的分化障礙是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的基本表型。當(dāng)G2期出現(xiàn)DNA損傷時(shí)，檢測(cè)點(diǎn)激酶1/2（Chk1/2）以毛細(xì)血管擴(kuò)張共濟(jì)失調(diào)突變（ATM）依賴的方式被激活，可磷酸化細(xì)胞分裂周期25蛋白磷酸酯酶（CDC25）從而抑制其活性，進(jìn)而抑制CDK1的去磷酸化作用，使其處于抑制狀態(tài)，CDC25與14-3-3σ蛋白相互作用，使cyclin B1/CDK1復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核受阻，故阻止細(xì)胞周期的進(jìn)行[20]。

為探討Andro對(duì)MHCC97H細(xì)胞增殖的抑制作用是否與細(xì)胞凋亡相關(guān)及對(duì)細(xì)胞周期的影響，本研究采用Annexin V-PI法及Hoechst 33342染色法觀察細(xì)胞凋亡情況，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。本研究結(jié)果顯示，Andro組MHCC97H細(xì)胞凋亡率升高，G2/M期細(xì)胞數(shù)量增加，表明Andro可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并使細(xì)胞阻滯于G2/M期。細(xì)胞周期中G2/M檢查點(diǎn)也稱為DNA損傷檢查點(diǎn)，其主要作用是確保細(xì)胞在S及G2期經(jīng)歷所有必要的變化，并為細(xì)胞分裂做好準(zhǔn)備，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生G2/M周期阻滯時(shí)，將會(huì)抑制細(xì)胞的增殖。為進(jìn)一步探討Andro誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯作用，本研究采用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)凋亡及周期相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，Andro可使MHCC97H細(xì)胞周期蛋白cyclin B1和CDK1表達(dá)下降，促凋亡蛋白Bax、cleaved-PARP、cleavedcaspase-3表達(dá)升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低。表明Andro促進(jìn)MHCC97H細(xì)胞凋亡并在G2/M期發(fā)生細(xì)胞周期阻滯的機(jī)制可能與其對(duì)MHCC97H細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、cleaved-PARP、cleavedcaspase-3、Bcl-2及周期相關(guān)蛋白cyclin B1、CDK1表達(dá)的調(diào)控有關(guān)。

mTOR-p70S6K信號(hào)通路作為細(xì)胞內(nèi)非常重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞周期、血管生成、自吞噬等過程中發(fā)揮著極其重要的生物學(xué)功能，該通路的紊亂會(huì)引起包括癌癥在內(nèi)的一系列的疾病[21]。mTOR在細(xì)胞的生長、增殖中起重要作用。mTOR在兩個(gè)結(jié)構(gòu)及功能不同的蛋白復(fù)合體中起作用，包括mTORC1及mTORC2[21]。作為mTOR復(fù)合體的一部分，mTOR可直接激活p70S6K以及對(duì)其Thr389位點(diǎn)的磷酸化。p70S6K在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖中起著明顯的重要作用[22，23]。研究報(bào)道指出Andro可通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路來誘導(dǎo)白血病細(xì)胞U937細(xì)胞凋亡與自噬[13]。然而目前，對(duì)于Andro是否能通過抑制mTOR途徑來抑制肝癌細(xì)胞的生長仍不清楚。本研究結(jié)果顯示Andro可降低mTOR、p70S6K的磷酸化水平，提示Andro可抑制mTOR-p70S6K信號(hào)通路的活性。

綜上所述，Andro可能通過調(diào)控MHCC97H細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、cleaved-PARP、cleavedcaspase-3、Bcl-2及周期相關(guān)蛋白cyclin B1、CDK1的表達(dá)及抑制mTOR-p70S6K信號(hào)通路的激活，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期發(fā)生阻滯，從而發(fā)揮體外抗肝癌作用。