柴白溫膽湯對動脈粥樣硬化大鼠內皮功能及MMP-9/TIMP-1的影響

李志尚， 蔡海榮， 馮文偉， 趙帥， 張為章，高煥佳， 趙子聰， 陳燕虹， 陳伯鈞

（1.廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣東廣州 510120；2.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東廣州，510405；3.東莞市中醫院，廣東東莞 523000）

《中國心血管病報告2017》指出我國目前約有2.9億心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）患者，心血管疾病死亡率居各病因之首[1]。心血管疾病不僅嚴重影響我國居民的健康和生活質量，而且對家庭和社會造成嚴重的經濟負擔[2]。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種動脈管壁增厚、變硬，失去彈性，管腔狹窄甚至堵塞的慢性非炎癥性疾病。動脈粥樣硬化是心血管疾病的重要病理基礎，影響著心血管疾病的發生和發展[3]。隨著社會的進步、生活方式的改變和人口老齡化進程的加速，動脈粥樣硬化的發病率呈現上升和年輕化的趨勢[4]。因此，積極干預動脈粥樣硬化對防治心血管病具有重要的意義。中藥具有多靶點、多成分、整體調節、協調作用強等優點[5]。有研究報道，溫膽湯加減可以降低頸動脈內中膜厚度、減少斑塊面積、抑制動脈硬化進程[6-8]。而柴白溫膽湯是陳伯鈞教授在溫膽湯基礎上化裁而成的經驗方，臨床治療冠狀動脈粥樣硬化具有良好的療效。本研究復制了動脈粥樣硬化模型，觀察柴白溫膽湯對動脈粥樣硬化內皮功能和MMP-9/TIMP-1的影響，初步探討其對動脈粥樣硬化的作用機制。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物及飼料SPF級健康雄性SD大鼠45只，4～5周齡，體質量（100±10）g。普通飼料按質量分數配方：蛋白質22%，脂肪10%，碳水化合物68%；高脂飼料按質量分數配方：基礎飼料65.3%，豬油15%，蔗糖10%，蛋黃5%，膽固醇4%，膽酸鈉0.5%，丙基硫氧嘧啶0.2%。大鼠和飼料均購自廣東省醫學實驗動物中心，許可證號：SYXK（粵）2013-0002。

1.2藥物柴白溫膽湯（半夏10 g，竹茹12 g，枳殼15 g，陳皮15 g，甘草6 g，茯苓20 g，柴胡12 g，白芍15 g，丹參15 g）中藥飲片均由廣州中醫藥大學第二附屬醫院藥劑科提供，由2名主任藥劑師鑒定為合格中藥飲片。煎煮方法：上述中藥飲片加6倍量的水浸泡30 min后煎煮40 min，濾渣取液；然后藥渣再加4倍量的水煎煮30 min，濾渣取液，2次藥液混合；然后100℃濃縮至2 g/mL，4℃保存。阿托伐他汀鈣片（美國輝瑞制藥有限公司），規格：20 mg/片，7片/盒，批號：20160262。

1.3試劑與儀器一氧化氮（nitric oxide，NO），內 皮 素 1（endothelin 1， ET-1）， 血 栓 素 B2（thromboxane B2，TXB2），6-酮-前列腺素F1α（6-keto-prostaglandin F1α，6-keto-PGF1α），基質金屬蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9），基質金屬蛋白酶抑制因子1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP-1）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒均購自美國賽默飛公司。FC5718R 230V多功能冷凍離心機[奧豪斯國際貿易（上海）有限公司]；ICS685k-35LA/f電子臺秤[梅特勒—托利多國際貿易（上海）有限公司]；日立-7180型全自動生化分析儀（株式會社日立高新技術公司）；Infinite M200TECAN酶標儀（瑞士TECAN集團公司）。

1.4造模、分組及給藥將45只大鼠進行適應性喂養7 d，待其代謝狀態穩定后，每只分籠喂養，隨機分為分為正常組（N=10）、造模組（N=35）。將35只大鼠參照劉煒楓等[9]方法復制動脈粥樣硬化大鼠模型。具體方法：造模第1天，給予維生素D3以60萬U/kg的劑量一次性腹腔注射，然后每天給予高脂飼料（20 g/d）喂養，分2次喂服。正常組大鼠于造模第1天給予等體積的生理鹽水一次性腹腔注射，然后給予普通飼料（20 g/d）進行喂養，分2次喂服。共喂養8周。造模期間所有大鼠均自由飲水。8周后從造模組隨機抽取5只模型大鼠，取腹主動脈組織進行光鏡和電鏡檢查以判斷造模是否成功，若有動脈內膜增厚或斑塊形成則提示造模成功。然后將剩余的30只大鼠隨機分為他汀組、模型組、柴白溫膽湯組，每組10只。按照“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”，他汀組給予阿托伐他汀鈣片（0.6 mg·kg-1·d-1）灌胃，柴白溫膽湯組給予柴白溫膽湯（16 g·kg-1·d-1）灌胃，正常組和模型組每天給予等體積的生理鹽水進行灌胃。共給藥4周。給藥期間所有大鼠自由進水和普通飼料進行喂養。

1.5取材第12周末將所有大鼠處死，處死前禁食不禁飲12 h，經腹腔注射100 g/L水合氯醛溶液（3 mL/kg）麻醉，然后于腹主動脈末端取血10 mL，6 000 r/min離心20 min后取上層血清，-70℃保存。

1.6ELISA檢測大鼠血清NO、ET-1、6-keto-PGF1α、TXB2、MMP-9、TIMP-1水平按照上述指標ELISA試劑盒說明書步驟，先將標準品稀釋后，然后加待測樣品10 μL和樣品稀釋液40 μL，溫育30 min，加蒸餾水30倍稀釋，洗滌，加酶，再溫育、洗滌，顯色，加入終止液，測定。

1.7統計方法采用SPSS 24.0軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），進一步兩兩比較采用LSD-t法檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1造模結果模型大鼠腹主動脈組織光鏡結果顯示：血管外膜外可見脂肪組織，中膜平滑肌細胞明顯增加，管壁增厚，血管內皮細胞下聚集了大量泡沫細胞，形成一個動脈粥樣硬化斑塊。見圖1-a。透射電鏡結果顯示：平滑肌細胞可見大量脂滴小泡，膜內見吞飲小泡，胞漿中見膽固醇結晶樣物質，細胞核中見異常染色質。見圖1-b。光鏡、透射電鏡結果均表明動脈粥樣硬化大鼠模型復制成功。

圖1 模型大鼠腹主動脈病理學改變Figure 1 The pathological features of the aorta abdominalis in the model rats

2.2各組大鼠血清NO、ET-1水平比較表1結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清ET-1水平明顯升高（P＜0.05），NO水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，柴白溫膽湯組大鼠血清ET-1水平明顯降低（P＜0.05），NO水平明顯升高（P＜0.05）；柴白溫膽湯組大鼠血清NO、ET-1水平與他汀組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠血清NO、ET-1水平比較Table 1 Comparison of the serum levels of NO and ET-1 in various groups （±s）

表1 各組大鼠血清NO、ET-1水平比較Table 1 Comparison of the serum levels of NO and ET-1 in various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組他汀組柴白溫膽湯組ET-1[ρ/（pg·mL-1）]75.69±11.26 128.34±10.83①89.68± 8.65①②91.38± 13.25①②N 10 10 10 10 NO[c/μmol·L-1）]68.54±8.25 31.26±7.51①46.85± 8.13①②45.27± 6.24①②

2.3各組大鼠血清6-keto-PGF1α、TXB2水平比較表2結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清6-keto-PGF1α水平明顯降低（P＜0.05），TXB2水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，柴白溫膽湯組大鼠血清6-keto-PGF1α水平明顯升高（P＜0.05），TXB2水平明顯降低（P＜0.05）；柴白溫膽湯組大鼠血清6-keto-PGF1α、TXB2水平與他汀組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠血清6-keto-PGF1α、TXB2水平比較Table 2Comparisonoftheserumlevelsof6-keto-PGF1α and TXB2 in various groups[±s，ρ/（pg·mL-1）]

表2 各組大鼠血清6-keto-PGF1α、TXB2水平比較Table 2Comparisonoftheserumlevelsof6-keto-PGF1α and TXB2 in various groups[±s，ρ/（pg·mL-1）]

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組他汀組柴白溫膽湯組6-keto-PGF1α 384.26±106.84 198.63±85.74①246.61± 72.38①②257.69± 95.73①②N 10 10 10 10 TXB2 126.87±46.92 268.76±84.46①184.34± 59.81①②196.28± 73.12①②

2.4各組大鼠血清MMP-9、TIMP-1水平比較表3結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清MMP-9水平明顯升高（P＜0.05），TIMP-1水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，柴白溫膽湯組大鼠血清MMP-9水平明顯降低（P＜0.05），TIMP-1水平明顯升高（P＜0.05）；柴白溫膽湯組大鼠血清MMP-9、TIMP-1水平與他汀組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠血清MMP-9、TIMP-1水平比較Table 3 Comparison of the serum levels of MMP-9and TIMP-1 in various groups[±s，ρ/（μg·L-1）]

表3 各組大鼠血清MMP-9、TIMP-1水平比較Table 3 Comparison of the serum levels of MMP-9and TIMP-1 in various groups[±s，ρ/（μg·L-1）]

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組他汀組柴白溫膽湯組TIMP-1 268.41±72.34 113.72±42.18①179.32± 51.36①②187.26± 57.21①②N 10 10 10 10 MMP-9 26.85±4.46 67.28±10.53①39.62± 7.25①②41.59± 9.13①②

3 討論

動脈粥樣硬化是冠心病、腦梗死等心腦血管疾病的病理基礎，具有較高的發病率、致殘率和致死率。目前，關于動脈粥樣硬化形成機制的經典學說是脂質代謝，但是血管內皮功能障礙和細胞外基質的降解等在動脈粥樣硬化的發生和發展中亦起到了重要的作用。內皮反應學說認為低密度脂蛋白、高血糖、高血壓、肥胖等多種危險因素均可以導致內皮損傷，引起內皮功能障礙，參與動脈粥樣硬化的發生、發展[10]。內皮功能障礙是動脈粥樣硬化的始動環節，內皮功能障礙與動脈硬化嚴重程度呈正比[11]。屈寶澤等[12]研究發現，冠心病、腦梗死、高血壓等疾病患者均伴有不同程度的內皮功能障礙。內皮細胞不僅可以調節血管張力、抑制血栓形成，而且可以分泌前列腺素和NO等血管舒張因子及血栓素A2、ET-1等血管收縮因子，通過調節收縮因子和舒張因子的動態平衡從而調節血管張力[13]。

NO和ET-1是一對重要的血管舒張和收縮調節因子，NO是最主要的內皮舒張因子之一，NO能舒張血管平滑肌，進而擴張血管，抑制血小板聚集、粘附，促進血小板降解，防止血栓形成，抑制白細胞—內皮細胞粘附，抑制平滑肌細胞的增殖，抑制低密度脂蛋白的合成，從而抑制動脈粥樣硬化的發生、發展[14]。ET-1是迄今發現的最強的血管收縮因子，與NO起拮抗作用，ET-1可以促進內皮平滑肌細胞增殖，破壞內皮的完整性和自我修復，促進動脈粥樣硬化的發生發展[15]。NO與ET-1的動態失衡即NO減少或ET-1增多，均可以引起內皮功能障礙，損傷血管內皮，引起動脈粥樣硬化。

前列腺素和血栓素A2是一對重要的調節血小板活性和血管張力的活性物質。前列腺素是重要的血管舒張因子，具有抑制血小板聚集、粘附，防止血小板聚集級聯反應所需的酶，進而抑制血小板的功能，從而防止血栓形成[16]。血栓素A2具有促進血管收縮和血小板粘附、聚集的功能，從而促進動脈粥樣硬化的發生發展。因為前列腺素和血栓素A2極不穩定，半衰期短，因而分別通過測定其代謝產物6-keto-PGF1α和TXB2來反映其體內水平。高血脂、高血壓等危險因素可以損傷內皮細胞，引起前列腺素生成減少，血栓素A2釋放增加，促進血小板聚集，誘導炎癥細胞浸潤，刺激平滑肌細胞增殖和遷移等，導致動脈粥樣硬化[17]。

細胞外基質是血管壁的重要組成部分，細胞外基質降解失衡在動脈粥樣硬化的發生發展過程中同樣起到了重要的作用，MMP-9/TIMP-1是一對重要的調節細胞外基質降解和生成的活性物質。基質金屬蛋白酶（MMPs）能特異性與細胞外基質結合并促進細胞外基質的降解，MMP-9是MMPS家族分子量最大的酶，可以促進細胞外基質，引起纖維帽溶解，導致斑塊不穩和破裂，形成血栓，堵塞血管，引起心腦血管事件[18]。TIMP-1是一種糖基化蛋白，是MMPs重要的調節因子，可以通過與MMP-9結合，進而抑制MMP-9與細胞外基質結合，從而阻止基底膜的降解，穩定斑塊，減少斑塊破裂[19]。而MMP-9/TIMP-1的動態失衡，表現為MMP-9增多或TIMP-1減少，都可以促進動脈粥樣硬化進展，引起斑塊不穩，甚至破裂。李子文等[20]研究發現MMP-9與心血管病患者動脈斑塊嚴重性具有一定的相關性。

動脈粥樣硬化屬于中醫學“痰濁”范疇，中醫學認為動脈粥樣硬化為本虛標實之病，氣滯是動脈粥樣硬化的始動因素，痰濁、瘀血是動脈硬化的重要病理產物，也是疾病的中心環節。氣為血之帥，氣行則血行，氣滯則血瘀，氣虛則血瘀，血行不暢，聚而成瘀，瘀血阻滯心脈、血管，痹阻不通。脾主運化水濕，肝木乘土，脾氣虧虛，脾虛運化失常，水濕代謝異常，聚痰成飲，且嶺南地區地處亞熱帶潮濕地帶，外濕困脾，脾不運化，聚痰成飲，痰濁阻滯心脈，痹阻不通。痰濁與瘀血互相膠結，痹阻血管，導致病程纏綿。柴白溫膽湯由溫膽湯化裁而來，方中半夏燥濕化痰，竹茹清熱化痰，陳皮理氣行滯、燥濕化痰，茯苓健脾利濕、杜絕生痰之源，柴胡疏肝解郁、理氣行滯，丹參活血化瘀，枳殼理氣寬中、行氣消脹，白芍、甘草養血柔肝，緩急止痛。綜合全方，共奏理氣行滯，活血化瘀，祛濕化痰之效。

本研究復制了動脈粥樣硬化大鼠模型，造模后給予相應的藥物干預4周。干預后，與對照組比較，模型組大鼠的ET-1、TXB2、MMP-9水平明顯升高（P＜0.05），NO、6-keto-PGF1α、TIMP-1水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，柴白溫膽湯組大鼠的ET-1、TXB2、MMP-9水平明顯降低（P＜0.05），NO、6-keto-PGF1α、TIMP-1水平明顯升高（P＜0.05）。提示柴白溫膽湯可以抑制動脈粥樣硬化大鼠ET-1、TXB2、MMP-9生成，促進NO、6-keto-PGF1α、TIMP-1的合成，從而調節血管內皮功能和細胞外基質降解平衡。

綜上所述，柴白溫膽湯可有效調控動脈粥樣硬化大鼠內皮功能和MMP-9/TIMP-1的平衡。