不同提取方法對(duì)油茶果殼多糖含量的影響

朱志東， 蔡延渠， 呂莉， 董碧蓮， 朱盛山

（廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心，廣東廣州 510006）

油茶（Camellia oleifera）屬山茶科，為常綠灌木或小喬木，我國是世界上山茶科植物分布最廣的國家，也是世界上最大的茶油生產(chǎn)基地，油茶籽提煉出來的山茶油，由于油酸和亞油酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在90%以上，被稱為“東方橄欖油”[1，2]。

隨著現(xiàn)代科學(xué)研究的不斷深入，油茶果殼的潛在價(jià)值也不斷被挖掘開發(fā)出來，油茶果殼可用來提取栲膠、糠醛以及木糖醇，還可用來制取活性炭和碳酸鉀[3]；生物活性研究表明，油茶果殼具有神經(jīng)保護(hù)作用、抗氧化、抗腫瘤、降血糖等功效[4-7]。目前，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)多糖提取的研究報(bào)道很多，但從油茶果殼中提取多糖的研究卻鮮有，更未見有關(guān)油茶果殼多糖提取率的報(bào)道。為了使油茶果殼中的有效成分被充分利用、提高其多糖的提取率，本研究采用多種提取方法，以多糖為指標(biāo)，采用苯酚—硫酸法結(jié)合紫外—可見分光光度法測(cè)定不同提取方法中多糖的含量，比較不同提取方法的提取率，以期為油茶果殼被更好地利用提供參考。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與儀器

1.1材料油茶果殼樣品產(chǎn)地來自廣東龍川，采集期為2016年10月份，由廣東龍川恒海油脂有限公司提供。樣品均經(jīng)廣東藥科大學(xué)李苑新副教授鑒定為山茶科山茶屬植物油茶Camellia oleifera的干燥果殼。純水、苯酚（分析純，天津市百世化工有限公司）；濃硫酸（分析純，天津市百世化工有限公司）；體積分?jǐn)?shù)95%乙醇（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；D-無水葡萄糖（中國食品藥品檢定研究院）。

1.2儀器D05臺(tái)式大容量低速離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）；KQ-500M超聲儀（東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司）；BP-211D電子分析天平（德國Sartorius公司）；UV-1700雙光束紫外分光光度計(jì)[島津企業(yè)管理（中國）有限公司]；EPED-10TF純水器（南京益普易達(dá)科技發(fā)展有限公司）；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；DHG-9203A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；DFY-300高速萬能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）。

2 方法

2.1油茶果殼多糖的制備將200 g油茶果殼粉碎，粉末，過80目篩，備用。

2.2樣品的提取工藝[8，9]

2.2.1 水提醇沉法 稱取油茶果殼粉末10 g，加入20倍量水浸泡1 h，90℃加熱提取3次，每次2 h，將提取液趁熱抽濾，取上清液濃縮至一定程度，加入乙醇醇沉至濃度為70%，冰箱4℃靜置過夜，取上清液65℃真空干燥，即得油茶果殼多糖物質(zhì)。同法平行提取3份。

2.2.2 醇水提取法 稱取油茶果殼粉末10 g，加入20倍量體積分?jǐn)?shù)70%乙醇浸泡1 h，90℃加熱提取3次，每次2 h，余者操作同上。同法平行提取3份。

2.2.3 超聲波—乙醇提取法 稱取油茶果殼粉末10 g，加入20倍量體積分?jǐn)?shù)70%乙醇浸泡1 h，90℃加熱并采用超聲（功率350 W）提取3次，每次0.5 h，余者操作同上。同法平行提取3份。

2.3油茶果殼多糖含量測(cè)定方法的建立（苯酚—濃硫酸法）[10，11]精密量取供試品溶液1 mL，空白對(duì)照為1 mL純水，分別精密加入純水2 mL，搖勻，精密滴加50 g/L苯酚溶液1 mL，搖勻，再垂直滴加濃硫酸5 mL，搖勻。置于電磁爐內(nèi)沸水浴15 min，取出后迅速加入冰水浴至室溫，得反應(yīng)液。在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出供試品溶液中的含糖量。

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒質(zhì)量的無水葡萄糖對(duì)照品10.01 mg，置100 mL容量瓶中，加純水溶解，定容，搖勻，配制成每1 mL中含無水葡萄糖0.1 mg的對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取油茶果殼多糖0.1 g，置于50 mL容量瓶中，加入超純水，超聲溶解，定容至刻度，搖勻，配制成每1 mL中含樣品2.0 mg的供試品溶液。

2.3.3 50 g/L苯酚試液的配制 取苯酚300 g，分別加入NaHCO30.15 g和鋁片0.25 g，常壓蒸餾，收集182℃蒸餾液，精密稱取25 g，置于500 mL棕色容量瓶中，溶解并定容至刻度，即得。

2.3.4 空白溶液的配制 精密量取純水3.0 mL，置于具塞干燥試管中，精密加入50 g/L苯酚溶液1 mL，搖勻。繼續(xù)精密垂直滴加濃硫酸5 mL，搖勻，沸水浴15 min，取出后迅速放入冰水浴冷卻至室溫，即得空白溶液。

2.3.5 最大吸收波長(zhǎng)的確定 分別精密吸取對(duì)照品、供試品溶液各1.0 mL，分別置10 mL具塞刻度試管中，加入50 g/L苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，100℃水浴15 min，取出后迅速冰水冷卻至室溫；另取1.0 mL純水，加入同量苯酚、濃硫酸，同法操作，作為空白對(duì)照。在400～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果表明對(duì)照品、供試品溶液在490 nm處均有最大吸收，故確定490 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.4方法與結(jié)果

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于具塞試管中，依次添加純水使各樣品終體積為1.0 mL，空白對(duì)照為純水1.0 mL，各加2 mL純水，精密加入50 g/L苯酚溶液1 mL，振搖混勻。垂直滴加濃硫酸5.0 mL，迅速振搖混勻，沸水浴15 min，迅速放入冰水浴中，冷卻至室溫。照分光光度法于波長(zhǎng)490 nm處分別測(cè)定吸光度[D（λ）]，根據(jù)數(shù)據(jù)以D（490 nm）值為縱坐標(biāo)、葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，作吸光度—葡萄糖質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1）。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程Y=0.070 2X+0.022 7（R2=0.999 9），準(zhǔn)確度較高，結(jié)果表明D-無水葡萄糖對(duì)照品在0.01～0.1 g/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of absorbance-glucose mass concentration

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液0.4 mL，按“2.4.1”項(xiàng)下方法連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算其D（490 nm）平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（sR）值。D（490 nm）平均值為0.420，sR=0.55%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液1.0 mL，平行制備6份，按“2.4.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算其D（490 nm）平均值和sR值。結(jié)果顯示，D（490 nm）平均值為0.415，sR=0.67%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液1.0 mL，按“2.4.1”項(xiàng)下方法每隔0.5 h測(cè)定吸光度值，連續(xù)4 h，計(jì)算其吸光度平均值和sR值。結(jié)果顯示，D（490 nm）平均值為0.420，sR=0.46%，供試品溶液在4 h內(nèi)顯色穩(wěn)定，表明本方法穩(wěn)定性良好。

2.4.5 回收率試驗(yàn) 精密吸取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的供試品溶液1.0 mL，分別加入質(zhì)量濃度0.1 g/L的D-無水葡萄糖對(duì)照品溶液0.5 mL和超純水0.5 mL，混勻，按“2.4.1”項(xiàng)下方法測(cè)定D（490 nm），計(jì)算其平均回收率。結(jié)果如表1所示，其平均回收率為99.38%，表明該法準(zhǔn)確性好。

2.5樣品含量測(cè)定精密稱取油茶殼多糖0.1 g，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液；按“2.4.1”項(xiàng)下方法操作及顯色，于紫外分光光度計(jì)測(cè)定D（490 nm），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出油茶果殼多糖的含量，各提取方法平行制備3份。各樣品油茶果殼多糖含量測(cè)定結(jié)果見表2。

3 討論

目前，對(duì)油茶果殼多糖資源的研究不斷深入，但是關(guān)于提高油茶果殼多糖提取率的問題需進(jìn)一步挖掘。本實(shí)驗(yàn)采用不同的提取方法制備油茶果殼多糖，以苯酚—硫酸法結(jié)合紫外分光光度法測(cè)定其含量，除了水提醇沉法，其他方法都是使用相同的溶劑進(jìn)行了提取，從測(cè)定的結(jié)果可見，水提醇沉法提取率最低，油茶果殼多糖含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為2.137%；超聲波—乙醇提取法提取率最高，油茶果殼多糖含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）5.425%。

表1 油茶果殼多糖回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The recovery results for polysaccharide extracted from the fruit shell of Camellia oleifera by different methods （n=6）

表2 不同提取方法樣品中油茶果殼多糖含量Table 2 Comparison of the content of polysaccharide extracted from the fruit shell of Camellia oleifera by different methods

本研究顯示，用水作為提取溶劑時(shí)，油茶果殼多糖的溶出量明顯低于用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇的溶出量，在同樣用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇提取時(shí)，醇水提取法和超聲波—乙醇提取法提取率都較高。這可能有以下幾方面的原因：①多糖的種類除了中性多糖外還含有酸性多糖，采用常規(guī)水提法，只能提出中性多糖，酸性多糖仍保留在藥材中[12]；而油茶果殼多糖以水為溶劑進(jìn)行提取，可能因提取不夠完全，所以多糖得率較低；②酸性多糖需用堿液溶劑去提取，在乙醇條件下，可促進(jìn)酸性物質(zhì)的溶出，并且破壞植物細(xì)胞的細(xì)胞壁，從而促進(jìn)酸性多糖的溶出[12]；③超聲波—乙醇提取法提取率最高的原因是超聲波的空化作用可加速有效成分的溶出，另外，超聲波產(chǎn)生的機(jī)械振動(dòng)、乳化、擊碎、化學(xué)效應(yīng)也可能加速多糖的擴(kuò)散釋放，并與溶劑充分混合，利于提取，所以其他的提取方法沒有超聲波—乙醇提取法提取率高。

在今后的研究中，待采用酸水提取、酶解提取、堿水提取、堿醇提取、菌發(fā)酵提取等方法進(jìn)行提取，比較其提取率，以制備更高純度的油茶果殼多糖。