制藥廢水廠抗性基因和微生物群落相關性研究

羅 曉袁立霞張文麗鐘為章蔣永豐張 迎徐東升

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制藥廢水廠抗性基因和微生物群落相關性研究

羅 曉1,2,袁立霞2,張文麗2,鐘為章1*,蔣永豐2,張 迎2,徐東升2

(1.河北科技大學環境科學與工程學院,河北 石家莊 050018；2.河北科技大學建筑工程學院,河北 石家莊 050018)

以2座制藥廢水廠的生物曝氣階段為例,結合Miseq測序分析技術和熒光定量PCR技術研究活性污泥中微生物群落和β-內酰胺類抗性基因的分布特征、擴增情況及其相關性. 結果表明:β-內酰胺類抗性基因OXA-1、OXA-2和OXA-10在2個水廠(J廠和K廠)中均能被檢出,OXA型基因豐度在K廠中為5.82×105~3.94×107copies/g(干重),在J廠的豐度范圍為4.84×107~1.09×1010copies/g,3種基因豐度在曝氣處理中顯著擴增. Miseq測序結果表明:K廠中主要優勢菌門為Proteobacteria,Planctomycetes,Bacteroidetes,Chloroflexi和Acidobacteria等,總平均相對豐度比例為82.13%;J廠中主要優勢菌門Proteobacteria, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Gemmatimonadetes和Thermi,總平均相對豐度比例為85.76%.冗余分析顯示:生物群落中、和等菌屬可能是OXA-1、OXA-2和OXA-10的主要攜帶菌屬;、和e可能是OXA-1的主要攜帶菌屬,、和可能是OXA-10的主要攜帶菌屬.

β-內酰胺類抗性基因；熒光定量PCR；Miseq；微生物群落結構

近些年,抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)和抗生素抗性細菌(antibiotic resistance bacteria,ARBs)被認為可能成為一種新型的環境污染物,其風險比抗生素藥物本身的污染風險更高[1],關于其行為特點和傳播途徑的研究也日益增加.抗生素抗性細菌對抗生素的耐藥性機理包括:細菌外膜不滲透性障礙、細菌外排泵系統、抗生素作用的靶位變化和抗生素的鈍化失活等[2].抗性基因是抗性菌具有抗性的主要原因之一,它可以通過多種形式的可移動遺傳元件如質粒、整合子、轉座子、插入序列等,突破細菌的種屬關系廣泛傳播,加重抗性污染[3].并且碳青霉烯類抗生素耐藥腸桿菌科細菌患病率上升迅速[4],這將對環境和人類健康構成嚴重的威脅[5-6].

熒光定量PCR技術為研究環境中抗性基因和抗性微生物分布特征提供了有力的手段[7].已有研究表明制藥廢水處理系統的進水中往往含有高濃度的抗生素及生產原料和中間體[8],對生物處理單元的微生物群落形成高強度選擇性壓力,為ARGs在污水中的持久存在和傳播擴散提供了有利條件,并且制藥廢水處理系統的出水中ARGs的濃度高于市政污水處理系統的出水[9-10].已有研究表明β-內酰胺類抗性基因廣泛存在于河流[11]和污水廠中[12],例如TEM-1廣泛存在于醫療廢水[13],污水廠[12],河流中[5].Yang等[14]發現在不動桿菌()中檢測到β-內酰胺類OXA型抗性基因.Zhang等[15]對東亞以及北美的15家污水處理廠的水質進行了調研,檢測出了多種β-內酰胺抗性基因如OXA-1、OXA-2、OXA-10、AmpC和TAM-1.Wang等[16]發現OXA-1和OXA-10型抗性基因廣泛存在于以CASS, MBR, EAAS, CAS, A2O等為主要處理工藝的制藥廢水處理廠,且檢出頻率為100%.抗生素廢水有機物濃度較高,成分復雜,難于處理,目前主要關注的是抗生素和相應抗性基因的相關性研究,缺乏抗性基因在降解過程中微生物群落和其相關性分析的深入研究.

本文選取兩座制藥廢水處理廠中生物曝氣階段為研究對象,利用Illumina MiSeq測序技術和熒光定量PCR技術,解析制藥廢水廠生物曝氣階段活性污泥中β-內酰胺類抗性基因和微生物群落結構在生物曝氣處理過程中的分布規律,并確定活性污泥中土著β-內酰胺類抗性基因和微生物特定菌屬的相關性,以期為評估廢水處理廠抗性基因和抗性菌環境風險提供依據,并制定有效的控制ARGs和ARBs的傳播策略.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

河北省某頭孢類制藥廢水處理站(K廠),該廠設計水量500m3/d,主要采用活性污泥法處理頭孢類生產廢水,污水處理流程為:調節池-一級曝氣池-初沉池-二級曝氣池-二沉池.樣品采用500mL聚乙烯瓶,于2017年10月,采集不同污水處理單元活性污泥樣品,分別標記為G(調節池)、D(一級曝氣池)、B(初沉池)、A(二級曝氣池)、C(二沉池);河北省某制藥廠(J廠),該廠設計水量300m3/d,用500mL聚乙烯瓶,于2018年1月,采集曝氣池(HB)和沉淀池(HC)中活性污泥.取樣結束后,于冰盒中運送回實驗室,離心(5min,11000r/min)后稱取5g冷凍于-80℃冰箱中,以備DNA提取.具體樣品編號及采樣信息見表1.

表1 兩制藥廢水廠樣品和相關水質信息

1.2 水樣分析

按照《水和廢水監測分析方法》[17]國家標準方法分析常規化學指標,測定水中CODcr和氨氮,測定均有3個平行,最后計算平均值.

1.3 DNA提取及PCR的擴增

DNA提取采用PowerSoil?DNA Isolation Kit試劑盒,按照試劑盒流程提取DNA.以所提取各樣品DNA為模板,對其16S rDNA V4區進行擴增.反應體系為30μL,上游引物為520F(5'-AYTGGGYD- TAAAGNG-3'),下游引物802R(5'-TACNVGGGTA- TCTAATCC-3').PCR擴增管中添加DNA模板0.5μL,正反向引物各0.6μL,滅菌水22.4μL,dNTP2.4μL,3μL緩沖液,ExTap酶0.5μL.PCR反應程序:先94℃預變性10min,然后進行30個循環(94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min),最后72℃延伸10min.

擴增結束后,運用1％瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行檢測,使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN)切膠回收DNA.PCR擴增后的條帶亮度明顯,位置清晰,可直接用于后續測序分析.委托北京理化分析測試中心進行Illumina MiSeq高通量測序.

1.4 抗性基因的定性檢測

采用PCR方法檢測β-內酰胺類抗性基因OXA-1,OXA-2和OXA-10,所用引物見表2.

抗性基因定性檢測反應體系為:10μL Green qPCR Master Mix,0.5μL引物(F),0.5μL引物(R),DNA模板1μL,加滅菌水至20μL.反應程序為:94℃ 5min;94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 5min,并在4℃下保存.每次運行使用無菌水做陰性對照,PCR產物以1%的瓊脂凝膠電泳分析.

表2 抗性基因所用的引物序列(參考文獻[18])

1.5 抗性基因的定量檢測

采用SYBR-Green 實時定量PCR方法對各基因進行定量分析,檢測儀器為StepOne型熒光定量PCR儀(ABI,美國).PCR產物經過克隆測序確認后,使用生工質粒提取試劑盒SK1131從陽性克隆子中提取質粒,用作標準曲線.使用NanoDrop微量分光光度計(Thermo Scientific,美國)測定質粒濃度.制作標準曲線時按照10倍梯度濃度稀釋構建好的各質粒,于90μL稀釋液中加入10μL質粒,做4~6個點,通過預實驗選取合適標準品用于制備標準曲線.標準質粒、環境樣品、陰性對照均做3個平行,取平均值進行計算.

質粒拷貝數換算公式

=[×10-9×6.02×1023]/[×660] (1)

式中:為質粒拷貝數,copies/μL;為質粒濃度, ng/μL;為克隆產物堿基數,g/mol.

熒光定量PCR反應體系為:12.5μL 2×SYBR, 1.0μL DNA(10ng/μL),0.5μL引物F (10mol/L), 0.5μL引物R(10mol/L),10.5μL水,總體積25.0μL.熒光定量PCR反應程序為:①50℃, 2min;②95℃,5min;③95℃, 20s;④退火,30s;⑤72℃, 31s;⑥Plate read,重復③~⑤,重復39次;⑦Melt-curve分析60~95℃.每隔0.2℃采集1次熒光以生成溶解曲線,根據溶解曲線變化檢測擴增結果的特異性.退火溫度和反應時間根據引物不同進行調整.

1.6 統計分析

抗性基因濃度結果和群落結構使用OriginPro 8.6軟件(Origin Lab Corporation,USA)進行分析;使用MOTHUR軟件計算各個樣本Alpha多樣性指標,以反映本次測序深度、物種均勻性等;使用R軟件對樣本繪制熱圖并分析;ARGs與群落結構相關性使用CANOCO 5.0(Microcomputer Power,Ithaca,NY)軟件分析.

2 結果討論與分析

2.1 微生物菌群耐藥基因定量檢測

利用熒光定量PCR的方法檢測β-內酰胺類抗性基因OXA-1,OXA-2和OXA-10在2廠中的分布特征和變化情況,結果如圖1所示.

圖1 水處理階段ARGs分布

由圖1可見,在K廠中,OXA型基因的豐度范圍為5.82×105~3.94×107(單位copies/g,含水率96.32%);J廠中,OXA型基因的豐度范圍為4.84×107~1.09× 1010,J廠比K廠的豐度高出2個數量級;且2廠中ARGs豐度沉淀階段均高于曝氣階段,K廠中沉淀階段豐度高于曝氣階段的1.03~3.77倍,J廠中沉淀階段豐度高于曝氣階段的1.57~2.50倍,說明沉淀階段是富集ARGs的主要階段;抗性基因OXA-1和OXA-2豐度在2廠中持續增長,OXA-10豐度在K廠中有下降,在J廠中上升;OXA-1在K廠中豐度范圍5.82×105~2.91×107,在J廠豐度范圍為(4.84~ 7.58)×107;OXA-2在K廠中豐度范圍(4.46~3.45)×106,在J廠豐度范圍為4.37×109~1.09×1010;OXA-10在K廠中豐度范圍2.61×106~3.94×107,在J廠豐度范圍為1.04× 108~4.95×109.其中,OXA-10基因豐度在K廠中削減,在J廠中上升,且其余2種抗性基因豐度在2廠均不同程度上升,這和余忻[19]的結果一致,其結果表明污水處理工藝雖可削減污水中耐藥乳糖發酵型腸桿菌科細菌數量和耐藥基因濃度,但會提高污水中的微生物對抗生素的耐藥率,并提高耐藥基因在微生物中的豐度,因此曝氣處理過程非但不能削減這2種ARGs豐度,反而刺激它大量擴增,是重要的抗性基因污染源頭.

2.2 微生物群落多樣性分析

為了進一步了解β-內酰胺類抗性基因及微生物群落結構在廢水處理過程中的分布和其相關性特征,采用Illumina高通量測序對活性污泥樣品中微生物菌群進行多樣性分析.

表3 活性污泥中菌群多樣性指數

表3為6個樣品的Alpha多樣性指標.其中, Chao1、Shannon和Simpson指數表明各處理單元細菌群落和物種的多樣性,其中豐富度指數Chao1可以估算群落中含OTU數目的指數,在生態學中常用來估計物種總數,值越大代表物種總數越多[20].從該指數來看, K廠中,Chao1指數和ACE指數呈現下降趨勢,下降幅度均為33.37%,說明后續處理水質穩定,功能性菌群占據主導地位造成群落結構逐漸集中化;而J廠的Chao1指數和ACE指數在升高,可能是J廠水質成分復雜COD,氨氮較高,菌群多樣性較高.

Shannon指數反映了基于物種數量的群落種類多樣性,指數越大表明群落的復雜程度越高[21],K廠隨著水質好轉,指數持續下降,下降的平均幅度為35.15%,J廠中指數升高,可能是水廠運行不穩定導致.Simpson指數體現了優勢物種生物量占群落生物總量的比重,該指數越大表明優勢菌群生物量占總生物量比重越大,反之則優勢菌群生物量占總生物量的比重越小[22],表3中K廠指數先下降后升高,優勢菌群生物量所占總生物量比重先下降后升高,J廠指數沒有發生變化,優勢菌群生物量所占總生物量比重不變.

2.3 微生物菌群結構分析

2.3.1 在門分類水平上分析 利用Miseq高通量測序分析技術在門水平上對測序結果進行歸類,分析所取7個污泥樣品的菌群組成及相對豐度差異,結果如圖2所示.

圖2 門水平下微生物群落相對豐度

由圖2可見,在門級別,兩制藥廢水廠各樣品中(G~HC)共統計到48個菌門.K廠污泥樣品中,變形菌門(Proteobacteria),浮霉菌門(Planctomycetes),擬桿菌門(Bacteroidetes),綠彎菌門(Chloroflexi),酸桿菌門(Acidobacteria)等為優勢菌門,平均總相對豐度比例占到82.13%,且總體差異較小.K廠主要優勢菌門與鄭向陽等[23]淀粉污水處理廠和AO反應器的優勢菌門種類大致相同,其總相對豐度差異可能是制藥廢水與淀粉污水在水質水量上的不同導致.在A和C單元中Proteobacteria和Bacteroidetes的相對豐度明顯升高,這和康曉榮[24]的研究,Proteobacteria和Bacteroidetes隨著總氮和總磷去除率的提高,其豐度也相應增加,具有重要的硝化及反硝化脫氮除磷作用的結論一致.Planctomycetes和Chloroflexi相對豐度逐漸減少;Bacteroidetes相對豐度逐漸升高; Acidobacteria相對豐度基本保持不變在4.60%左右,且5種主要菌門在整個處理流程中占到總相對豐度77.03%~88.41%.J廠污泥樣品中,變形菌門(Proteobacteria),擬桿菌門(Bacteroidetes),疣微菌門(Verrucomicrobia),芽單胞菌門(Gemmatimonadetes),棲熱菌門(Thermi)等為優勢菌門,總平均相對豐度比例占到85.76%.其中J廠的變形菌門在所有活性污泥樣品中所占的比例也最多,HB的相對豐度為60.00%,HC的相對豐度為56.55%.

兩廠中變形菌門在所有活性污泥樣品中所占的比例最多,占每個活性污泥樣品細菌總相對豐度的37.66%~63.38%范圍內,為主要優勢菌門.這與Liu等[25]研究結果一致,其通過構建實驗室規模生物造粒流化床反應器對不同時期的微生物群落進行多樣性分析,所得的18個分類操作單元中,有11個屬于變形菌門,3個屬于放線菌門,表明變形菌門在污水處理中屬于較優勢的細菌類群.說明不僅僅是污水處理,制藥廢水處理中的優勢菌門也為變形菌門.

2.3.1 在屬分類水平上分析 在屬水平上對樣品及其所含菌屬進行聚類分析,并根據各樣品中不同OTU所含豐度繪制熱圖,以反映在菌屬水平上聚類差異及群落結構差異性,如圖3所示.

從總體來看,K廠與J廠在菌群結構上差異性較大,為便于分析,將各樣品微生物熱圖劃分為3個Cluster.從Cluster 1和Cluster 2來看,K廠與J廠菌群豐度差異性較大,其中,B和D與其余單元菌屬豐度差異性較大,豐度較高的是、、、和等菌類,其中,(硝化螺菌)是活性污泥中起硝化作用的主要菌屬之一[26],K廠中豐度較高,反映出K廠脫氮效果強于J廠.A和C單元與其他樣品單元差異性較大,差異性較大的菌屬為、和等,其中是活性污泥中與反硝化作用有關的菌屬[27],在K廠中豐度較高.從脫氮相關菌屬豐度可看出K廠較J廠氨氮去除效果好.Cluster 3包含、、、和等菌屬,其中,是活性污泥中與反硝化作用有關的菌屬[27],在好氧和厭氧的條件下都有良好的脫氮效果[28].

圖3 屬水平下的前50個物種相對豐度

有研究表明,活性污泥中與反硝化作用有關的主要菌屬包括:、、、、和等[27].在本研究中,也發現了、和等可能參與反硝化作用的細菌類群,其相對豐度如表4所示.由表4可知,為J廠中豐度最高菌群,并且(陶厄氏菌屬)是主要的反硝化脫氮微生物,在反硝化以及芳香族化合物的降解過程中起了十分重要的作用[29],為K廠豐度最高菌群,且各菌屬隨水質變化成一定的演替規律.

表4 各樣品反硝化相關菌群相對豐度

變化較為明顯的是、、、、、a17、等,其中Nitrospira(硝化螺菌)是活性污泥中起硝化作用的主要菌屬之一[26];(芽孢桿菌屬)為污水廠中廣泛存在的菌屬[30-31].從Cluster 3來看,1B與1C的相對菌屬豐度較高,分別為,,等,其中(生絲微菌屬)為病原菌[32],且對污染土壤有較好的修復能力.Cluster 4大部分菌群屬于硝化菌、反硝化菌,并且(陶厄氏菌屬)是主要的反硝化脫氮微生物,在反硝化以及芳香族化合物的降解過程中起了十分重要的作用[29];(副球菌屬)在好氧和厭氧的條件下都有良好的脫氮效果[28].

2.4 微生物群落和抗性基因相關性分析

2.4.1 主成分分析和冗余分析 微生物群落結構會影響ARGs的產生和豐度[14],但是微生物群落結構在環境樣本中對ARGs擴增影響的研究還是有限的.通過高通量測序和熒光定量方法來分析污水處理系統中微生物群落和抗性基因分布的相關性.

首先對2座廠的6個樣本進行主成分分析(圖4a),然后選取COD、氨氮、抗性基因OXA-1, OXA-2和OXA-10作為環境因子,結合各樣本微生物群落結構,選取2廠中15種相對豐度較高的菌屬作為樣本,利用冗余分析(RDA)方法研究微生物與環境因子的相關性,結果見圖4b.

對6個樣本進行主成分分析,結果(圖4a)表明,PC1(主成分1)表示2組間差異中可以解釋全面分析結果的85.36%,PC2(主成分2)表示2組間差異中可以解釋全面分析結果的12.92%,2點之間的距離越近,表明2個樣本之間的微生物群落結構相似度越高,差異越小.從圖中可看出3組間應該有明顯的差異性,J廠的HC和HB樣本單元分布較近,K廠的D和B單元分布較近,其余K廠的A和C單元分布較近,這3組組內的微生物群落結構相似度較高,且每組樣本與樣本之間的距離呈現一定的變化規律.

a. 樣本主成分分析;b. 微生物與環境因子

對6個樣本進行冗余分析,結果表明(圖4b),主軸1和主軸2共解釋了微生物群落結構和水質、抗性基因參數的98.04%,其中,微生物群落中、、以及等菌屬與-,-和-3種抗性基因和氨氮呈正相關,、和e等與-抗性基因呈正相關,、和與COD和-呈正相關,和與COD正相關.

在制藥廢水活性污泥中,Bdellovibrio、KD8-87、Paracoccus以及B-42等菌屬可能是-、-和-3種抗性基因的主要攜帶菌屬,、和可能是-的主要攜帶菌屬,其中Guo等[33]從Comamonas sp.GTP4(Comamonadaceae)中檢測到-型抗性基因全序列;、、和可能是-分布的主要攜帶菌屬,其中Laviad等[34]從AIMA4 (DSM 19884)(Betaproteobacteria)中檢測到-基因的全序列,Amiri等[35]從SWB007(Myxococcales)中檢測到-基因的全序列.Ellin6075和Methyloversatilis與COD正相關,可能是這2種菌屬較適應有機負荷高的污水.其余菌屬可能是未被檢測發現,有待進一步研究.

3 結論

3.1 β-內酰胺類抗性基因-,-,-在2個水廠中各個階段的檢出頻率均為100%.生物曝氣處理過程非但不能削減-和-豐度,反而刺激它大量擴增,是某些抗性基因的重要污染源頭.二級曝氣處理系統對β-內酰胺類-型抗性基因有一定的去除效果.

3.2 兩制藥廢水廠中,K廠中主要優勢菌門為變形菌門(Proteobacteria),浮霉菌門(Planctomycetes),擬桿菌門(Bacteroidetes),綠彎菌門(Chloroflexi),酸桿菌門(Acidobacteria),平均總相對豐度比例占到82.13%.J廠污泥樣品中,主要優勢菌門為變形菌門(Proteobacteria),擬桿菌門(Bacteroidetes),疣微菌門(Verrucomicrobia),芽單胞菌門(Gemmatimonadetes),棲熱菌門(Thermi),總平均相對豐度比例占到85.76%.

3.3 生物群落中、KD8-87、以及B-42等菌屬可能是、和3種抗性基因的主要攜帶菌屬,、和可能是抗性基因的主要攜帶菌屬,、、和可能是的主要攜帶菌屬.

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Correlation study between resistance genes and microbial communities in pharmaceutical wastewater treatment plants.

LUO Xiao1,2, YUAN Li-xia2, ZHANG Wen-li2, ZHONG Wei-zhang1*, JIANG Yong-feng2, ZHANG Ying2, XU Dong-sheng2

(1.School of Environmental Science and Engineering, Hebei University of Science & Technology, Shijiazhuang 050000, China；2.School of Civil Engineering, Hebei University of Science & Technology, Shijiazhuang 050000, China)., 2019,39(2)：831~838

The distribution characteristics, amplification and correlation of microbial communities and β-lactam resistance genes in active sludge were studied by Miseq sequencing analysis and fluorescence quantitative PCR. The samples of active sludge were obtained from the biological aeration stages of two pharmaceutical wastewater treatment plant (Plant J and K). β-lactam resistance genes OXA-1, OXA-2 and OXA-10can be detected in both plants. The abundance of OXA gene was 5.82×105~3.94×107copies/g (dry weight) in K plant and was 4.84×107~1.09×1010copies/g in J plant. The Abundance of three genes in aeration treatment is significantly amplified. Miseq sequencing showed that the main dominant bacterium were Proteobacteria, Planctomycetes, Bacteroidetes, Chloroflexi and Acidobacteriain K plant and the total average relative abundance ratio was 85.76%. The main dominant bacterium were Proteobacteria, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Gemmatimonadetesand Thermiin J plant, the total average relative abundance ratio was 85.76%. Redundancy analysis display showed that、andin biological community were the major distribution factors of OXA-1、OXA-2 and OXA-10.、ande were the major distribution factor of OXA-1.、andwere the major distribution factor of OXA-10.

β-lactam resistance genes；fuorescence quantitative PCR；miseq；microbial community structure

X172

A

1000-6923(2019)02-0831-08

羅 曉(1973-),男,廣東崖縣人,副教授,博士,主要從事水污染控制研究.發表論文50余篇.

2018-07-10

國家自然科學基金資助項目(51708170)

* 責任作者, 講師, zhongweizhang@aliyun.com