生物有機肥對核桃園土壤細菌群落結構的影響

張凱煜，谷 潔，王小娟，高 華

( 西北農林科技大學資源環境學院，陜西 楊凌 712100 )

土壤微生物是土壤生態系統中的重要組成部分，對土壤物質轉化和養分循環，維持土壤肥力和可持續利用至關重要，在農業土壤生態系統中的作用越來越受到關注[1-2]。核桃在黃龍縣栽培歷史悠久[3]。近年來，農民粗放式的施肥管理模式存在盲目性，長期大量施用化肥也會影響土壤微生物活性，進而降低作物的產量和品質，并造成一定的環境問題[4-5]。

生物有機肥是將外源功能菌接種到堆肥產品，即以畜禽糞便、農作物秸稈等為原料，經腐熟的有機肥產品。具有生物肥料和有機肥效應，有利于增產增收，還能培肥土壤，減少化肥的用量，同時實現農業廢棄物資源化利用[6-7]。張婷婷[8]研究了不同施肥對核桃生長和品質的影響，提出施用生物菌肥和骨粉可有效提高核桃園土壤中有機質含量。楊建榮等[9]發現，生物有機肥的應用能顯著提高核桃產量，改善土壤保水性和供肥能力。研究表明，施用生物有機肥能調節土壤中微生物組成[10]，提高作物抗病性[11-12]，使土壤健康發展。杜瀅鑫等[13]利用PCR-DGGE和Biolog發現不同植物根際土壤微生物組成不同。Araújo等[14]通過T-RFLP方法發現，土地退化降低了土壤細菌的多樣性，影響了細菌群落結構組成。由于高通量測序技術具有測序深度深和獲得數據量大等優點，可揭示復雜微生物群落的多樣性，加快了環境中不可培養和痕量微生物的研究[15]，已成為研究微生物群落變化的主要方法之一。朱金山等[16]利用高通量測序技術對不同沼灌年限稻田土壤的微生物群落結構進行了分析，從門、綱、目、科、屬5個水平上全面展示了稻田土壤微生物群落結構的分布。在化肥和生物有機肥處理下，土壤細菌群落的響應差異，不同處理土壤微生物區系的差異如何？哪些關鍵因素能夠影響微生物進而調控土壤養分循環，還需要進一步研究。

本研究在試驗區設置了不同施肥處理試驗，采用高通量測序法比較不同施肥種類對土壤細菌群落結構和多樣性的影響，并結合土壤性狀揭示細菌群落變化的驅動因子，旨在從土壤微生物生態的角度豐富生物有機肥的促生理論，闡明施肥管理措施影響土壤肥力的生物學機制，為指導核桃合理施肥提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗于2016年9月在陜西省延安市黃龍縣三岔鄉進行(109°83′ N，35°58E)，供試品種為香鈴。供試的生物有機肥由西北農林科技大學自制(添加的主要功能菌為解磷菌和解鉀菌，有效活菌數達2.8×108cfu·g-1)，有機質含量28.3%、氮(N) 3.8%、磷(P2O5) 2.6%、鉀(K2O) 3.1%。試驗設置3個處理，CK(不施肥)，TN(常規施肥，施肥量為復合肥1 350 kg·hm-2，含N 15%、P2O515%、K2O 15%)，TB(施生物有機肥，施肥量為5 325 kg·hm-2，以化肥養分氮含量折算即N 202.5 kg·hm-2、P2O5138 kg·hm-2、K2O 165 kg·hm-2)。一年兩次施肥，即基肥、追肥，施肥量各占50%。

1.2 土壤樣品采集

于2017年9月沿種植行，樹干周圍50 cm的根系密集分布區，使用“S形”五點法采集土壤樣品。采樣時去掉易受水分及各種環境因素影響的表層干土后，取5～20 cm土壤樣品，用無菌鑷子去除殘留根系后裝入無菌自封袋，用冰盒迅速帶回實驗室。取1份樣品經冷凍干燥后，用于微生物群落結構分析，另1份風干過篩，用來測定理化指標。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 土壤DNA提取 土壤樣品DNA使用FastDNA SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals，美國)進行提取。利用Nanodrop Spectrophotometer ND-1000 (Thermo Fisher Scientific，美國) 檢測DNA濃度和純度，確保樣品濃度和純度合格后，保存于-80℃冰箱。

1.3.2 高通量測序 將土壤DNA樣品寄送至北京諾禾致源科技股份有限公司，進行16S rRNA基因V3-V4可變區高通量測序。通過UPARSE將序列在97%相似水平下進行聚類，獲得可操作分類單元(OTUs)。利用QIIME進行抽平、RDP分類，得到樣品OTUs詳細的注釋結果，進行后續分析。

1.3.3 土壤理化性質的測定 測定方法參考土壤農化分析[17]。

1.4 數據處理與分析

數據采用SPSSv 19.0進行統計分析和方差分析(LSD，P<0.05)，用Microsoft Excel 2013進行繪圖。利用CANOCO 4.5軟件進行冗余分析，R軟件繪制熱度圖。

2 結果與分析

2.1 土壤化學性質

從表1可以看出，與CK處理相比，TB處理中有機質、全氮、全磷分別增加了46.3%、30.6%和50.8%。生物有機肥的施用顯著提高了核桃園土壤中全磷、全氮和有機質含量(P<0.05)。全鉀含量在不同處理間無顯著差異，在14.3～14.6 g·kg-1波動。各處理速效養分含量大小順序為：TB>TN>CK，其中TB處理速效磷和速效鉀含量分別達CK處理1.76倍和1.78倍。

2.2 土壤細菌群落多樣性

高通量測序結果顯示每個樣品OTUs稀釋性曲線均趨于平坦(圖1)，說明測序數據量和測序深度合理，可包括土壤樣品中的大部分的細菌類型。分析了代表微生物群落α-多樣性的辛普森指數、Chao1、香濃指數和ACE指數，其值越高表示微生物多樣性、物種豐富度越高[18]。由圖2可見，TB處理α-多樣性指數均高于CK和TN處理，而TN處理香濃指數和ACE指數有所降低。

2.3 土壤細菌群落結構

基于門水平，分析了不同土壤樣本序列(圖3),共得到35個門水平類群。結果顯示優勢類群包括變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)，芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)，共占細菌總量的85.2%～90.6%。進一步比對分析，共得到291個屬水平類群，其中鞘脂單細胞菌屬(Sphingomonas,phylum-Proteobacteria, 6.6%～10.0%)節桿菌屬(Arthrobacter,phylum-Actinobacteria, 2.3%～4.7%)為優勢類群(圖4)，TB處理較CK處理分別增加了17.6%和56.6%，較TN處理分別增加了51.5%和104.3%。

圖1 土壤樣本稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of soil samples

表1 不同施肥處理下的土壤化學性質

圖2 不同施肥處理下的土壤細菌群落α-多樣性指數Fig.2 Abundances of bacterial community α-diversity indexes under different fertilizer treatment

以門水平上細菌相對豐度和與土壤pH、有機質、堿解氮、全氮、速效磷、全磷、速效鉀、全鉀進行冗余分析(圖5)，可分析細菌群落和多個響應變量(土壤理化性質)之間的關系[19]。結果顯示，所選取的環境因子共解釋細菌群落變化的94.6%，RD1軸解釋了82.5%，RD2軸解釋了12.1%。其中土壤有機質、堿解氮和速效鉀含量為不同施肥處理間細菌群落差異的主要驅動因子。

圖3 基于門水平的不同施肥處理下土壤細菌群落組成Fig.3 Soil bacterial community composition in different fertilization treatments at phylum level

圖4 不同施肥處理下的土壤細菌群落優勢菌屬Fig.4 Predominant genera of soil bacterial community in different fertilization treatments

注：TP：全磷；AN：堿解氮；OM：有機質；AK：速效鉀；AP：速效磷；TK：全鉀；TN：全氮。Note: TP: Total phosphorus; AN: Alkali-hydrolyzable N; OM: Organic matter; AK: Available K; AP: Available P; TK: Total potassiam; TN: Total nitrogen.圖5 不同施肥處理下的環境因子對細菌群落結構的RDA排序圖Fig.5 Redundancy analysis between soil properties and the bacterial community structure

3 討 論

生態系統穩定性及土壤肥力發生變化的關鍵因素是人為向土壤中大量輸入外源物質，尤其是肥料[20-21]，不同的施肥方式和肥料類型影響又有所不同。生物有機肥的施用能夠提高土壤有機質和全氮含量，這與前人研究結果相似[22]。常規施肥對土壤速效養分的提高效果不如生物有機肥，尤其是土壤中速效鉀和速效磷含量。這可能主要是因為生物有機肥中含有解磷菌、解鉀菌可作用于土壤中難溶的磷和鉀，釋放出大量速效磷、速效鉀。生物有機肥既能在作物生長前期快速提供一定的速效養分，又可在作物生長過程中通過微生物分解有機質和礦物質釋放養分，發揮速效和長效兼有的作用，養分的緩慢釋放還可為微生物提供更穩定的棲息環境，起到“接種”和“導入”作用[23- 24]。

土壤細菌在土壤養分循環和系統維穩中起重要作用[25]。本研究結果表明，施用生物有機肥顯著增加了土壤細菌群落多樣性，可能是因為施肥處理中較高的有機質和養分，為更多的微生物提供了生長和繁殖的條件，其中包括生物有機肥中本來攜帶的大量功能菌[26]。與不施肥相比，常規施肥卻降低了細菌群落香濃指數和ACE指數，這與蘇婷婷等[11]的研究結果相似。Liu等[27]通過Biolog方法發現施用有機肥處理香濃指數顯著高于化肥處理，Chen等[28]發現接種微生物菌劑能夠顯著提高土壤豐富度指數。綜上表明，生物有機肥優于常規肥料的關鍵因素就在于這些功能菌的生命活動。

通過對不同施肥處理對細菌群落結構的分析，得到35個門水平和291個屬水平的類群。結果表明，不同處理中優勢的門、綱和目水平上優勢物種相似，但不同處理處理間，門、綱和目水平物種相對豐度不盡相同。變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門為優勢門類，這與某些前期研究結果相似[16, 29]。而不同研究中物種豐度差異較大，說明農田土壤中細菌群落優勢物種種類相似，但其相對豐度會受土壤類型、種植作物類型以及施肥灌溉方式等的影響[30-31]。放線菌門在土壤氮素循環中起重要作用，還能促進土壤中植物殘體的腐爛。本研究中，各處理放線菌門豐度大小為TB>TN>CK，與全氮和堿解氮趨勢一致，這與王伏偉等[32]研究相似。他研究了施肥和秸稈還田對砂漿黑土細菌群落的影響，發現施肥和秸稈還田顯著提高了放線菌門的相對豐度,并且土壤全氮含量是提高其相對豐度的重要原因。而楊亞東等[29]研究結果表明在OTUs水平上細菌群落結構與全氮含量顯著相關,但門水平上則相關性不顯著。這表明全氮含量對細菌不同分類學水平上的群落結構影響存在差異。在屬水平上，不同處理中，鞘脂單細胞菌屬和節桿菌屬菌為優勢物種，但在不同處理中相對豐度不同(TB>CK>TN)。鞘脂單細胞菌屬可以促進根際營養吸收，抵抗多種病原菌，是降解土壤有毒物質最有效的微生物菌屬之一。也有研究發現，鞘脂單細胞菌屬中部分菌株具有固氮特性，在土壤氮素轉化方面起重要作用[33]。節桿菌屬可以通過固氮作用產生多種植物激素，以促進水分和礦質元素的吸收。由此可見，施用生物有機肥可以促進優勢菌的富集，促進營養和水分等吸收，其是否能提高根際微生物抗病抗毒害能力，還需要今后長期試驗來證實。

土壤微生物群落組成會受到環境變化的影響，可以作為土壤質量變化的指標。武發思[34]研究發現有機肥對根際土壤細菌多樣性的增加和群落結構的改變作用明顯。本文采用冗余分析(RDA)來研究環境因子對微生物群落的影響，將RDA分析加入高通量生物信息分析，能夠更直觀地表達影響研究區土壤細菌群落特征的主要土壤環境因素，是分析土壤微生物信息的有效方法，能夠為土壤環境評價以及土地利用管理提供科學依據。RDA結果表明，施肥處理即TB和TN處理在RD1軸上與CK處理顯著區分，有機質、堿解氮和速效鉀是土壤細菌群落結構改變的主要驅動因子。有機質改變了土壤孔隙度、通氣度與土壤團粒結構[35]，具有一定的緩沖作用，作為土壤酶的重要載體，為土壤微生態環境提供化學反應場所，為細菌活動提供適宜條件。而堿解氮和速效鉀對細菌群落結構影響較大，可能和核桃本身養分需求相關。

4 結 論

施生物有機肥可顯著提高核桃園土壤養分，使土壤理化性質得到改善，且生物有機肥效果優于常規施肥。施生物有機肥增加了土壤細菌群落多樣性，在一定程度上還提高了土壤中優勢菌屬的相對豐度。不同施肥處理改變了細菌群落結構和組成，冗余分析結果表明，土壤有機質、堿解氮和速效鉀含量是影響細菌群落變化的主要驅動因子。本研究采用了高通量測序的方法，結合環境因子對土壤細菌群落對不同施肥處理的響應進行了分析，后續可以利用宏基因組和宏轉錄組的方法，對參與碳、氮、磷循環功能微生物的表達、代謝途徑進行深入研究。