表沒食子兒茶素沒食子酸酯對糖尿病大鼠心臟的保護作用及對TGF-β 1/Smad3信號通路表達的影響

孫敬茹，陳克研，孫倩，韓梅

（1. 遼寧省金秋醫院內分泌科，沈陽 110016； 2. 中國醫科大學實驗動物部，沈陽 110122）

糖尿病心肌病 （diabetic cardiomyopathy，DC） 是糖尿病的一種較常見的并發癥，目前已經證明心肌異常和糖尿病之間存在因果關系。據統計，DC約占糖尿病患者的12%，并可能導致心力衰竭和死亡［1-3］。鏈脲佐菌素 （streptozocin，STZ） 對胰島β細胞有細胞毒性作用，短期高糖高脂飲食聯合STZ腹腔注射是目前較常用的誘導2型糖尿病動物模型的常用方法［4-6］。表沒食子兒茶素沒食子酸酯 （epigallocatechin gallate，EGCG） 是從綠茶中提取的兒茶素類單體，是茶多酚主要的活性和水溶性成份，是兒茶素中含量最高的組分［7］。因其特殊的化學結構，具有較強的抗氧化能力，目前主要用于抗腫瘤和預防心血管疾病［8］。本研究在建立2型糖尿病大鼠模型的基礎上給予EGCG，觀察其對糖尿病大鼠心肌損傷的保護作用，進一步探討其對TGF-β 1/Smad3信號通路表達的影響，為DC的防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級SD大鼠，雄性，體質量200～220 g，由北部戰區總醫院實驗動物科提供，通過實驗動物福利倫理審查，動物自由飲食水。采用隨機數字表法將動物平均分成4組，分別為假手術組 （Sham組） 、2型糖尿病心肌病模型組 （DC組） 、EGCG組［于糖尿病模型建立成功后，腹腔注射EGCG （100 mg/kg） 28 d］和二甲雙胍陽性對照組［Met組，于糖尿病模型建立成功后，每天給予大鼠二甲雙胍灌胃 （140 mg/kg） ，連續28 d］。

1.2 糖尿病大鼠模型建立

大鼠飼喂高脂飼料8周。用0.1 mmol/L無菌枸櫞酸緩沖液配置為6.5 g/ L、pH4.3的STZ溶液，腹腔注射40 mg/kg，72 h后檢測血糖，血糖≥16.7 mmol/L認為造模成功。

1.3 樣本采集與檢測

于給藥28 d后用生理記錄儀檢測各組大鼠心臟功能，收集血液，一部分送檢驗科檢測甘油三酯（triglyceride，TG） 、總膽固醇 （total cholesterol，TC） 、糖化血紅蛋白 （blood hemoglobin ALC，HbAlc） 和空腹血糖 （fasting blood glucose，FBG） ，另一部分分離血清用于ELISA檢測。另取心臟組織樣本，一部分固定于多聚甲醛中，剩余部分于-80 ℃冰箱保存。

1.4 ELISA檢測

為觀察EGCG對DC氧化應激、心功能的影響，采用ELISA試劑盒 （南京建成生物技術有限公司） 檢測超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD） 、丙二醛 （methane dicarboxylic aldehyde，MDA） 、過氧化氫酶 （catalase，CAT） 和谷胱甘肽過氧化酶 （glutathione peroxidase，GPX） 的含量，具體步驟參照說明書進行：在酶標板上加入標準品，依次倍比稀釋；每孔加入血清樣本100 μ L，37 ℃溫育60 min，洗滌液洗滌5次；每孔加入50 μ L酶標二抗，37 ℃溫育30 min；每孔加入顯色劑A和B各50 μ L，37 ℃避光顯色15 min；每孔加入終止液50 μ L；酶標儀檢測450 nm處的吸光度值，繪制標準曲線，計算樣品濃度。

1.5 Masson染色觀察心肌組織

甲醛固定組織48 h后，進行脫水、透明、浸蠟后對心肌組織進行石蠟包埋，將包埋好的心肌組織連續切片后，將切片脫蠟至水，用Regaud蘇木精染液染色5 min，充分洗滌，鹽酸乙醇分化3～5 s，用Masson麗春紅酸性復紅液染色5 min，以2%冰醋酸水溶液浸洗，1%磷鉬酸水溶液分化3 min，光綠液染5 min；以0.2%冰醋酸水溶液浸洗，95%乙醇、無水乙醇、二甲苯透明、中性樹膠封固。

1.6 Western blotting檢測大鼠心肌組織中轉化生長因子 β 1 （transforming growth factor β 1， TGF-β 1）、pSmad3和Smad3表達

將心肌組織置于含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中，于冰上對心肌組織進行勻漿，收集上清液后，使用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量，對蛋白進行SDS-PAGE電泳、用PVDF膜轉膜后，加入TGF-β 1 （ab92486） ，Smad3 （ab40854） ，pSmad3（ab52903） 抗體，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h后，使用ECL發光試劑盒和凝膠成像系統對蛋白進行顯色，結果使用Image Tools進行吸光度分析。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 EGCG對DC大鼠血糖和血脂的影響

與Sham組相比，DC組大鼠TG、TC、HbA1c和FBG水平顯著升高，差異有統計學意義 （P ＜ 0.05）；與DC組相比，EGCG組和Met組大鼠TG、TC、HbA1c和FBG水平顯著降低，差異有統計學意義 （P ＜ 0.05） 。見表1。

2.2 EGCG對DC大鼠心臟功能的影響

表1 各組大鼠TG、TC、HbA1c和FBG水平的變化 （s，n = 10）Tab.1 TG，TC，HbA1c，and FBG levels in the rats in each group （s，n = 10）

表1 各組大鼠TG、TC、HbA1c和FBG水平的變化 （s，n = 10）Tab.1 TG，TC，HbA1c，and FBG levels in the rats in each group （s，n = 10）

1） P ＜ 0.05，compared with Sham group； 2） P ＜ 0.05，compared with DC group.

Sham 0.682±0.084 1.712±0.532 25.731±3.224 5.272±1.082 DC 1.374±0.0931） 5.417±0.6721） 39.853±2.8821） 18.531±1.8841）EGCG 0.871±0.0672） 3.212±0.4112） 26.532±1.8312） 6.742±0.9412）Met 0.822±0.0692） 2.182±0.3412） 25.984±2.1122） 7.032±1.1162）

與Sham組相比，DC組大鼠左心室舒張末期壓力 （left ventricular end dilated pressure，LVEDP） 、左心室收縮壓 （left ventricular systolic pressure，LVSP）和左心室內壓上升段/下降段最大變化速率 （maximal rate of the increase/decrease of left ventricular pressure，±dp/dtmax） 的絕對值均顯著下降，差異有統計學意義 （P ＜ 0.05）；與DC組相比，EGCG組和Met組大鼠LVEDP、LVSP和±dp/dtmax的絕對值均顯著升高，差異有統計學意義 （P ＜ 0.05） 。見表2。

2.3 EGCG對DC大鼠血清SOD、MDA、CAT和GPX 水平的影響

表2 各組大鼠心功能指標變化s，n = 10）Tab.2 Cardiac function indexes in the rats in each group s，n = 10）

表2 各組大鼠心功能指標變化s，n = 10）Tab.2 Cardiac function indexes in the rats in each group s，n = 10）

1） P ＜ 0.05，compared with Sham group； 2） P ＜ 0.05，compared with DC group.

Sham 1.573±0.075 19.732±1.231 1 562.342±184.531 1 348.921±219.413 DC 0.652±0.0841） 12.842±1.4411） 785.275±87.9311） 681.937±73.4941）EGCG 1.273±0.0922） 17.617±1.8242） 1 242.280±113.1172） 884.441±88.3232）Met 1.259±0.0772） 17.942±1.6612） 1 318.470±109.8422） 949.821±98.7172）

與Sham組相比，DC組大鼠血清中MDA水平顯著升高，而SOD、CAT和GPX水平顯著降低，差異有統計學意義 （P ＜ 0.05）；與DC組相比，EGCG組和Met組大鼠血清中MDA水平顯著降低，而SOD、CAT和GPX水平顯著升高，差異有統計學意義 （P ＜ 0.05） 。見表3。

2.4 Masson染色

表3 各組大鼠氧化應激因子水平變化 s，n = 10）Tab.3 Oxidative stress factor levels in the rats in each group （s，n = 10）

表3 各組大鼠氧化應激因子水平變化 s，n = 10）Tab.3 Oxidative stress factor levels in the rats in each group （s，n = 10）

1） P ＜ 0.05，compared with Sham group； 2） P ＜ 0.05，compared with DC group.

Sham 607.531±27.832 2.131±0.292 658.542±19.231 556.812±12.394 DC 452.440±31.2261） 7.577±0.2311） 251.136±14.6541） 301.180±16.8311）EGCG 533.430±28.9312） 5.127±0.1732） 339.837±16.8342） 388.920±18.9422）Met 554.484±21.0402） 4.994±0.2022） 349.853±10.9312） 406.810±15.3362）

與Sham組相比，DC組大鼠心肌組織見大量膠原沉積，心肌纖維化程度較重；與DC組相比，EGCG組和Met組偶見少量膠原沉積，心肌纖維化程度明顯改善，均趨于正常化。見圖1。

2.5 Western blotting檢 測TGF-β 1、pSmad3和Smad3蛋白表達

圖1 Masson染色檢測各組大鼠心肌組織病理學變化 ×200 Fig.1 Masson staining was used to detect pathological changes in the cardiac muscle tissues of the rats in each group ×200

與Sham組相比，DC組心肌組織中的TGF-β 1、pSmad3表達升高，差異有統計學意義 （P ＜ 0.05）；與DC組相比，EGCG組和Met組TGF-β 1、pSmad3蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義 （P ＜ 0.05）；EGCG組和Met組TGF-β 1、pSmad3蛋白表達相近，差異無統計學意義 （P ＞ 0.05）；各組Smad3表達差異均無統計學意義 （P ＞ 0.05） ，見圖2。

圖2 Western blotting法檢測心肌組織中TGF-β 1、pSmad3和Smad3蛋白表達水平Fig.2 Western blotting analysis of the expression levels of TGF-β 1，p-Smad3，and Smad3 proteins in rat cardiac muscle tissues

3 討論

研究［9］表明，高脂飲食合并STZ誘導的糖尿病大鼠會出現嚴重的心肌損傷，主要表現為心臟功能障礙、心肌氧化應激增加以及心肌纖維化。本研究利用Masson染色、ELISA和Western blotting等技術觀察EGCG對大鼠心臟組織、血糖、血脂、心功能、氧化應激因子及TGF-β 1/Smad3通路蛋白表達的影響。結果提示，EGCG可以減輕糖尿病導致的心肌損傷，其機制可能與TGF-β 1/Smad3信號通路有關。糖尿病可以引起嚴重的心功能損傷，甚至導致心力衰竭和死亡。積極預防DC的發生發展一直都是急需解決的重點和難點。本研究為DC提供了實驗理論依據。

糖尿病是一種胰島素分泌絕對或相對不足的代謝性疾病，常常表現為以高血糖為典型特征的代謝紊亂，并伴隨心臟、腦、腎臟等嚴重并發癥，其中心血管并發癥已經成為糖尿病主要死亡原因，其臨床主要表現為心臟舒張和收縮功能障礙以及心肌結構的改變［10］。有研究［11］表明，DC患者體內氧化應激明顯增強，是導致心肌收縮和舒張功能障礙的主要因素。本研究發現，模型建立后，大鼠出現嚴重的血脂異常和高血糖現象，心臟收縮和舒張障礙，心肌結構損傷嚴重，大鼠心臟和血清中氧化應激產物MDA含量明顯增高，而抗氧化應激酶SOD、CAT和GPX顯著降低。提示糖尿病可導致嚴重的心肌損傷和代謝紊亂，其可能與大鼠體內氧化應激增強有關。

EGCG是從綠茶中提取的一種主要的生物活性多酚，已被發現具有強效的抗氧化劑和自由基清除特性。 EGCG對心血管功能具有多種有益作用，包括減少心肌損傷，減輕體外和體內缺血后心肌功能障礙。張妍淞等［12］研究發現，EGCG對阿霉素引起的心血管損傷具有顯著的保護作用，其保護作用與降低心肌細胞凋亡，提高抗氧化防御和保護線粒體有關。本研究建立DC大鼠模型，予EGCG干預，發現EGCG可以緩解糖尿病導致的代謝紊亂，對心臟功能結構具有保護作用，能夠抑制氧化應激反應。其對糖尿病大鼠心肌的保護作用可能與抑制氧化應激有關。

TGF-β作為調節細胞分化和生長的TGF-β超家族的成員，主要作用為促進成纖維細胞、成骨細胞和雪旺氏細胞的生長［13］。Smad3是TGF-β 1/ Smad3信號通路激活的標志，已有研究［14］證實，TGF-β 1/Smad3信號通路途徑可調節糖尿病大鼠的氧化應激水平。KO等［15］的研究表明，EGCG能改善慢性阻塞性肺疾病大鼠的肺損傷，其作用機制與調控肺TGF-β /Smad3水平、抑制氧化應激和炎癥反應有關。本研究建立2型糖尿病心肌病模型，心肌組織中TGF-β 1、Smad3表達升高，經EGCG干預后，TGF-β 1、Smad3蛋白表達顯著降低。提示糖尿病所導致的心肌損傷可能與促進TGF-β 1、Smad3表達，增強氧化應激有關，而EGCG可以通過TGF-β 1/Smad3信號通路途徑介導氧化應激來保護糖尿病大鼠心肌損傷。