α-硫辛酸對高脂飲食肥胖小鼠術后空間學習記憶功能的影響

肥胖在全球有流行趨勢,據估計,全球超過11億成人超重,其中3.12億人屬于肥胖。肥胖不僅易引發心腦血管病變、2型糖尿病、腫瘤,近年來發現肥胖病人發生術后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction, POCD)的風險增加[1]。α-硫辛酸(α-LA)具有降低血脂、抗炎及抗氧化作用,神經保護作用也逐漸被報道,但具體機制尚不明確[2-3]。近些年,關于POCD的研究取得了很多的進展[4-7]。然而,對于肥胖病人POCD發病機制及有效的防治手段一直沒有定論。本研究擬觀察α-LA對高脂飲食(HFD)誘導的肥胖小鼠術后空間學習記憶功能的影響,并探討可能的機制。

1 對象與方法

1.1 一般資料 120只雄性C57BL/6小鼠(14周)購于北京維通利華實驗動物有限公司[批號SCXK (京)-2011-0011]。飼養于SPF級動物房,室溫(24±1)℃,自由進食飲水,實驗結束后苯巴比妥鈉處死。

1.2 實驗方法 小鼠被隨機分為6組(對照組, 對照+手術組,對照+α-LA+手術組,HFD組, HFD+手術組,HFD+α-LA+手術組),每組20只。HFD、HFD+手術組和HFD+α-LA+手術組小鼠每日用高脂飼料(D12492, 60 kcal% Fat, Research diets, Inc, USA)喂養,其他組普通飼料喂養,持續12周。對照+α-LA+手術組和HFD+α-LA+手術組用α-LA(惠氏制藥有限公司, 蘇州) 100 mg/(kg·d)灌胃,持續12周,其他組等體積生理鹽水灌胃。手術模型采用50 mg/kg苯巴比妥鈉腹腔內注射麻醉,肝左葉及中葉切除。對照組和HFD組只接受麻醉處理。

1.3 行為學測試 術后第1～4天空間航行實驗記錄逃避潛伏期和游泳速度,第5天空間探索實驗記錄穿臺次數及原平臺象限滯留時間。

1.4 蛋白檢測及透射電鏡觀察 術后第5天行為學測試結束后即刻取海馬,免疫熒光法檢測casepase 3、Bcl-2表達情況。透射電鏡觀察海馬神經元、突觸結構,計算突觸密度、突觸界面曲率、突觸后活性區長度、突觸間隙寬度和突觸后致密物質(postsynaptic density,PSD)厚度。

2 結果

2.1 一般資料 HFD組、HFD+手術組體質量分別明顯高于對照組、對照+手術組(P<0.01)。HFD+α-LA+手術組高脂飲食后14～84 d體質量明顯低于HFD組和HFD+手術組(P<0.01)。見圖1。

圖1 各組高脂飲食期間體質量變化比較注:與對照組比較,*P<0.01;與對照+手術組比較,#P<0.01;與HFD+手術組比較,△P<0.01

2.2 水迷宮結果 術后第1天定位航行實驗中,對照+手術組、對照+α-LA+手術組、HFD+手術組和HFD+α-LA+手術組逃避潛伏期均明顯長于HFD組和對照組(P<0.01),HFD+手術組和HFD+α-LA+手術組游泳速度明顯小于其他4組(P<0.01)。術后第2～4天,對照+α-LA+手術組逃避潛伏期明顯短于對照+手術組(P<0.01或P<0.05)；HFD+α-LA+手術組逃避潛伏期明顯短于HFD+手術組(P<0.01),長于對照+α-LA+手術組(P<0.01)；HFD+手術組游泳速度明顯小于其他5組(P<0.01)。術后第3～4天，HFD+手術組逃避潛伏期明顯長于對照+手術組。術后第5天空間探索實驗中,對照+α-LA+手術組穿臺次數及原平臺象限滯留時間明顯多于對照+手術組(P<0.01),HFD+α-LA+手術組穿臺次數及原平臺象限滯留時間明顯多于HFD+手術組(P<0.01)。對照+α-LA+手術組和HFD+α-LA+手術組的穿臺次數及原平臺象限滯留時間組間比較差異無統計學意義。見圖2。

注: A、B為術后第1～4天定位航行實驗; C、D為術后第5天空間探索實驗。與對照組比較,*P<0.01;與對照+手術組比較,&P<0.01;與HFD組比較,#P<0.01;與HFD+手術組比較,△P<0.01圖2 水迷宮結果

2.3 免疫熒光結果 術后第5天對照+α-LA+手術組海馬casepase 3、Bcl-2蛋白表達水平明顯低于對照+手術組(P<0.01);HFD+α-LA+手術組casepase 3、Bcl-2蛋白表達水平明顯低于HFD+手術組(P<0.01)。對照+α-LA+手術組與HFD+α-LA+手術組的casepase3、Bcl-2蛋白表達水平，組間比較差異無統計學意義。見圖3。

2.4 透射電鏡結果 術后第5天，對照組和HFD組小鼠海馬區神經元胞漿和胞核染色質分布均勻,細胞核形態規則,核膜光滑；其他組小鼠海馬區神經元的超微結構發生了不同程度的病理改變。對照+手術組和HFD+手術組神經細胞核固縮,核膜凹陷、皺縮。對照+手術組突觸密度、活性區長度、PSD厚度明顯小于對照+α-LA+手術組(P<0.01)；HFD+手術組突觸密度、活性區長度、PSD厚度明顯小于HFD+α-LA+手術組(P<0.01)突觸密度，對照+α-LA+手術組和HFD+α-LA+手術組的活性區長度、PSD厚度組間比較差異無統計學意義。見表1。

表1 各組透射電鏡下海馬突觸結構比較(±s)

注:與對照+手術組比較,*P<0.01;與HFD+手術組比較,△P<0.01

注: A為術后第5天海馬casepase3表達; B為術后第5天海馬Bcl-2表達;與對照+手術組比較,*P<0.01;與HFD+手術組比較,△P<0.01圖3 術后第5天6組海馬casepase3、Bcl-2表達比較

3 討論

大量研究顯示,術后學習記憶功能下降與海馬神經元及突觸數量減少、結構改變有關[8]。肥胖病人術后認知功能下降明顯[9],具體機制及有效防治措施尚不明確。本研究采用HFD造肥胖小鼠模型，肝部分切除術后1～5 d發現小鼠的學習記憶功能明顯下降。

α-LA是已知天然抗氧化劑中效果最強的一種,近年來,α-LA對神經細胞的保護作用取得很多研究者的認同。已報道的神經保護機制包括抑制凋亡信號調節激酶1/死亡結構域相關蛋白(ASK1/DAXX)信號、激活PI3K/AKT或PI3K/ERK途徑等[10-11]。有研究發現α-LA調控突觸可塑性蛋白[12],通過線粒體途徑抑制神經元細胞凋亡[13]。本研究結果顯示,α-LA干預12周可明顯改善HFD小鼠術后學習記憶功能,降低小鼠體質量,降低海馬casepase 3、Bcl-2表達水平。

突觸界面結構參數是反映突觸結構可塑性的敏感性指標, 與突觸的功能狀態及神經信息傳遞有重要的聯系。突觸界面曲率是突觸前后膜隔著突觸間隙相對應界面的曲率, 既反映神經遞質釋放的狀況, 又是突觸后膜上受體蛋白分子構像變化的標志。突觸活性區是突觸前膜與聚集成簇的突觸小泡相接觸形成的區域, 代表神經遞質釋放的有效面積。突觸間隙是一個神經元與另一個神經元信息溝通的部位, 其大小與形態對突觸活動的動力學有重要影響。PSD由突觸后膜內側胞漿中的蛋白復合體組成, 其中蛋白表達的改變就會引起PSD厚度的變化, 影響突觸的傳遞效率。PSD厚度越大, 越有利于神經元之間的相互溝通[15]。本研究結果顯示，α-LA干預12周后，小鼠的海馬突觸密度、活性區長度、PSD厚度明顯改善，說明α-LA可維持小鼠神經元、突觸正常結構。

綜上所述,α-LA對HFD誘導的肥胖小鼠術后學習記憶功能有保護作用,其機制可能與抑制海馬神經元凋亡,維持神經元、突觸正常結構有關。