鼠李糖乳桿菌在防御鼠傷寒沙門菌感染中的保護(hù)作用

邵麗娜，馮博，廖野，段冰潔，楊文濤，王春鳳，胡靜濤

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林省動(dòng)物微生態(tài)制劑工程研究中心，動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130118)

乳酸菌(lacticacidbacteria，LAB)是一類無芽孢的、革蘭氏陽性細(xì)菌，作為FAO和WHO定義的益生菌重要代表成員，在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮著益生功能。一方面，乳酸菌本身能在腸道內(nèi)定植、維護(hù)腸道菌群平衡，通過產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素等抗菌物質(zhì)抑制腸道內(nèi)有害菌的生長(zhǎng)[1]；另一方面，乳酸菌在腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)中也發(fā)揮了重要作用，因其特有的定植位置和益生功能與腸道黏膜底層細(xì)胞關(guān)系密切、參與免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)和活化。因此，乳酸菌常應(yīng)用于預(yù)防和治療腸道病原菌感染引起的炎癥和腹瀉[2-3]。由于乳酸菌成員眾多、菌株作用復(fù)雜多樣，因此在影響機(jī)體免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)方面具有很強(qiáng)的菌株依賴性。部分菌株在宿主病理?xiàng)l件下(如壞死性小腸結(jié)直腸炎和過敏性機(jī)體)發(fā)揮抑制炎癥效應(yīng)；而某些菌株在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，其能通過促進(jìn)TNF-α、IL-12和IL-8等細(xì)胞因子從而促進(jìn)炎癥發(fā)生。這些有免疫調(diào)節(jié)活性的菌株在活菌或滅活的情況下，均得到了相似的結(jié)果[4]。盡管如此，已知免疫活性較好的菌株仍然有限，本實(shí)驗(yàn)以在抑制慢性腸炎等方面具有潛在效應(yīng)的LGG作為模式菌株[5]，深入研究LGG參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用，以開發(fā)更多益生菌株的潛在作用。

鼠傷寒沙門菌為革蘭氏陰性菌，通過食入被污染的水造成人和動(dòng)物胃腸道系統(tǒng)疾病[6]。該病原能夠耐受胃腸道的酸性環(huán)境，進(jìn)入小腸后，侵入腸道粘液層，入侵的細(xì)菌可被消化酶、分泌型IgA、抗菌肽以及其它固有免疫防御分子所清除。作為一種腸道模式病原菌，能在腸道中大量繁殖破壞腸黏膜上皮細(xì)胞屏障及菌群的平衡從而引發(fā)腸道類疾病。此外，它還能夠通過巨噬細(xì)胞攝取從而破壞細(xì)胞緊密連接，進(jìn)而轉(zhuǎn)移到黏膜下層，造成動(dòng)物腸道疾病。這種逃逸免疫系統(tǒng)是沙門菌存活的重要機(jī)制[7]。而LGG在建立黏膜屏障，提高免疫機(jī)能和活化抗原遞呈細(xì)胞如巨噬細(xì)胞(Macrophage，Mφ)等方面具有突出優(yōu)勢(shì)[8]。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建鼠傷寒沙門菌的腸炎模型，以評(píng)價(jià)LGG對(duì)該模型的防御保護(hù)作用，為L(zhǎng)GG在預(yù)防和治療腸道病原菌感染方面奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及菌株

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠，購買于長(zhǎng)春億斯試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，均飼養(yǎng)在恒溫(21～22 ℃)房間。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株 鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusGG, LGG)ATCC53103由吉林省動(dòng)物微生態(tài)制劑工程研究中心實(shí)驗(yàn)室保存,鼠傷寒沙門菌(S.typhimurium，Sty)SL1344由河南科技大學(xué)程相朝教授惠贈(zèng)并于吉林省動(dòng)物微生態(tài)制劑工程研究中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑和儀器 硫酸鏈霉素(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司)；瓊脂粉、無水乙醇、二甲苯、中性樹膠、蘇木精-伊紅染色(北京化學(xué)制劑公司)；4%多聚甲醛(solarbio)； PBS緩沖劑(HyClone)； mouse NO Elisa試劑盒、IL-10 Elisa試劑盒、IL-12 Elisa試劑盒(上海朗頓)。高溫烘箱DHG-9240A (上海一恒公司)；低溫超速離心機(jī)3V3O(德國(guó)SIGMA公司)；電子分析天平ME204(島津國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司)；培養(yǎng)箱LRH-250F(上海一恒公司)；漩渦振蕩器MX-S(大龍興創(chuàng)公司)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀Multiskan Go(Thermo Fisher Scientific)。

1.3 鼠傷寒沙門菌感染腸炎模型的建立及分組

1.3.1 腸炎模型建立 6～8周齡SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠口服硫酸鏈霉素20 mg/100μL，提供飲水和飲食。鏈霉素處理24 h后，給小鼠口服5×107CFU/100μL的鼠傷寒沙門菌[9]。感染后48 h無菌收取腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟進(jìn)行器官指數(shù)和沙門菌荷菌數(shù)檢測(cè)，H&E染色檢測(cè)腸道的病理變化，ELISA檢測(cè)腸道細(xì)胞因子分泌水平等。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 將小鼠隨機(jī)分為4組，每組5只。第1組為生理鹽水對(duì)照組(命名為Saline)：每天灌胃100 μL生理鹽水，連續(xù)灌胃9 d。第2組為鼠李糖乳桿菌對(duì)照組(命名為L(zhǎng)GG)：在造模前提前7 d灌胃5×108CFU/100μL鼠李糖乳桿菌，此后灌胃等量生理鹽水直到第9天；第3組為沙門菌感染模型組(命名為Sty)：在造模前提前7 d灌胃100 μL生理鹽水；第4組為鼠李糖乳桿菌干預(yù)組(命名為L(zhǎng)GG+Sty)：造模前提前7 d灌胃5×108CFU/100μL鼠李糖乳桿菌，Sty組和LGG+Sty組第8天開始按照1.3.1方法感染鼠傷寒沙門菌，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)過程中無小鼠死亡。

1.4 腸道病理分析 無菌PBS沖洗盲腸、結(jié)直腸內(nèi)容物，截取1 cm腸段固定于4%多聚甲醛中，石蠟切片及蘇木精-伊紅染色：梯度脫水-透明-浸蠟-包埋-切片-烤片-脫蠟-水化-蘇木精染核-1%鹽酸分化-0.5%氨水反藍(lán)-伊紅染色-梯度脫水-透明-封片。具體參考Myunghoo Kim[10]的步驟,并對(duì)病理損傷進(jìn)行分析。

1.5 器官指數(shù)分析 取小鼠脾臟、肝臟、盲腸、結(jié)直腸樣品進(jìn)行稱重，按照器官重量/尸重，計(jì)算器官指數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.6 器官中沙門菌荷菌數(shù)的檢測(cè) 無菌取脾臟、肝臟，稱重后將樣品用預(yù)冷PBS進(jìn)行研磨并稀釋。取100 μL稀釋好的樣品涂布在濃度為20 mg/mL硫酸鏈霉素的LB瓊脂板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，觀察菌落狀態(tài)并計(jì)數(shù)。

1.7 細(xì)胞因子檢測(cè) PBS沖洗取盲腸內(nèi)容物并置于研缽中液氮研磨，4 ℃ 3500 r/min離心20 min，取上清用于檢測(cè)組織中分泌的細(xì)胞因子水平，檢測(cè)方法按照eBioscience ELISA試劑盒說明書方法操作，并在酶標(biāo)儀450nm處讀取吸光值。

1.8 體重及存活率檢測(cè) 采取1.3.1和1.3.2方法進(jìn)行模型建立及分組，監(jiān)測(cè)小鼠體重并觀察小鼠一般狀態(tài)及記錄死亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 LGG對(duì)沙門菌引起腸道損傷的緩解作用 病理檢測(cè)結(jié)果如圖1顯示，LGG和Saline組結(jié)直腸和盲腸腺體完整，無出血點(diǎn)；Sty組腸道的大部分腺體被破壞，腸黏膜脫落，有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及出血點(diǎn)；而LGG+Sty組腺體結(jié)構(gòu)較完整，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和出血點(diǎn)。結(jié)果表明LGG可以有效緩解鼠傷寒沙門菌造成的腸道病理損傷。

圖1 結(jié)直腸和盲腸的病理變化Fig 1 Colon and cecum pathology change

2.2 LGG能改善沙門菌引起小鼠的器官損傷 檢測(cè)脾臟器官指數(shù)如圖2a、2b所示，Sty組脾臟眼觀明顯比Saline組腫大且器官指數(shù)顯著增加(P<0.01)，而LGG+Sty組脾臟腫大有所緩解，并且器官指數(shù)較Sty組明顯下降(P<0.05)。盲腸器官指數(shù)如圖2c所示，Sty組盲腸內(nèi)容物減少且重量減輕。 Sty與LGG+Sty組比較差異顯著(P<0.05)，LGG和LGG+Sty組盲腸器官指數(shù)較Sty組有所改善。結(jié)果表明LGG能緩解沙門菌引起小鼠的器官損傷。

a：脾臟眼觀病理變化程度；b：脾臟的器官指數(shù);c：盲腸的器官指數(shù)a: Degree of pathological changes in the spleen eye; b: Organ index of the spleen; c: Organ index of the cecum圖2 脾臟及盲腸的器官指數(shù)Fig 2 Organ index of the cecum and spleen

2.3 LGG對(duì)沙門菌侵襲器官組織的影響 對(duì)小鼠盲腸、脾臟、肝臟以及腸系膜淋巴結(jié)的沙門菌荷菌數(shù)檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。Saline和LGG組器官中并未檢測(cè)到沙門菌，而LGG+Sty比Sty組脾臟和肝臟的荷菌數(shù)顯著減少(P<0.001)，腸系膜淋巴結(jié)的荷菌數(shù)顯著減少(P<0.01)，說明LGG能有效抑制沙門菌侵襲其他器官組織。

圖3 沙門菌在體內(nèi)器官定植分布數(shù)量檢測(cè)Fig 3 Detection of S.typhimurium loads in tissue

2.4 LGG對(duì)細(xì)胞因子分泌水平的影響 如圖4a、4b所示LGG+Sty組一氧化氮(NO)和白細(xì)胞介素-12(IL-12)分泌水平顯著降低 (P<0.001)。而如圖4c所示白細(xì)胞介素-10(IL-10)分泌顯著增加(P<0.05)。初步表明LGG可能通過調(diào)節(jié)Th2型細(xì)胞因子的分泌，維持腸道免疫平衡，緩解腸道炎癥反應(yīng)。

2.5 LGG對(duì)小鼠體重及死亡情況的影響 小鼠體重監(jiān)測(cè)結(jié)果如圖5a所示，Saline和LGG組小鼠體重緩慢上升，LGG+Sty比與Sty組體重丟失有所緩解。小鼠存活率監(jiān)測(cè)如圖5b可見Saline和LGG組無小鼠死亡。Sty組在第11天全部死亡，而LGG+Sty與Sty組相比死亡率有所降低。結(jié)果表明，LGG對(duì)感染鼠傷寒沙門菌的小鼠體重丟失有一定的改善，并且能緩解沙門菌引起的小鼠死亡。

a:促進(jìn)炎性細(xì)胞因子IL-12分泌水平； b:炎性介質(zhì)細(xì)胞因子NO分泌水平；c：抑制炎性細(xì)胞因子IL-10分泌水平a: Promote inflammatory cytokine IL-12 secretion level; b: Inflammatory mediator cytokine NO secretion level;c: Inhibit inflammatory cytokine IL-10 secretion level圖4 盲腸組織細(xì)胞因子檢測(cè)Fig 4 Cecal tissue cytokine detection

a：小鼠的體重情況監(jiān)測(cè)；b：小鼠的死亡情況監(jiān)測(cè)a: Detection of body weight in mice; b: Detection of death in mice圖5 小鼠體重變化及存活率的監(jiān)測(cè)Fig 5 Detection of body weight change and survival rate in mice

3 討論與結(jié)論

鼠傷寒沙門菌是一種胞內(nèi)寄生的腸道病原菌，能引起人和動(dòng)物腸道疾病。近年來，濫用抗生素增強(qiáng)了細(xì)菌的耐藥性，破壞了微生態(tài)環(huán)境。為尋找抗生素的替代物，益生菌以能在腸道定植的優(yōu)勢(shì)逐漸成為研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)評(píng)估了LGG在鼠傷寒沙門菌誘導(dǎo)腸炎模型中的作用，發(fā)現(xiàn)LGG+Sty組能改善腸道組織的病理損傷，減少鼠傷寒沙門菌侵襲器官組織的能力，改善小鼠的體重及死亡率，說明LGG能緩解鼠傷寒沙門菌引起的腸道炎癥，這與Jian Ji等[12]的研究一致。這一過程可能與LGG參與激活機(jī)體的免疫防御功能、緩解機(jī)體的炎癥反應(yīng)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)LGG能調(diào)節(jié)腸道Th1和Th2細(xì)胞因子的分泌水平，減少NO和IL-12分泌以及增強(qiáng)IL-10分泌，這與Trine Eker Christoffersen等[13]的研究一致，表明乳酸菌在調(diào)節(jié)和維持腸道免疫平衡方面具有重要作用[14]。這些研究為L(zhǎng)GG在緩解鼠傷寒沙門菌誘導(dǎo)腸炎的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

乳酸菌對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制十分復(fù)雜，免疫細(xì)胞(如Mφ)在免疫調(diào)節(jié)的過程中也扮演著重要角色。LGG與Mφ共作用，使Mφ產(chǎn)生NO、IL-12和IL-10等細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)Mφ的免疫功能及吞噬能力，參與模式識(shí)別受體(PRRs)包括ToLL樣受體(TLRs)、Notch、核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路等，這些通路之間的相互作用調(diào)節(jié)Mφ的免疫功能，降低機(jī)體的炎癥反應(yīng)。因此我們有必要對(duì)LGG緩解鼠傷寒沙門菌誘導(dǎo)的腸炎作用機(jī)制進(jìn)一步探索，從而為炎癥疾病提供新的治療方向。