響應(yīng)面法優(yōu)化重樓藥材中甾體皂苷的回流提取工藝研究

王仕寶，蘇 瑩，李會寧，楊培君 ，吳 鵬

(1.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001)

中藥材重樓為百合科重樓屬(Paris)植物的泛稱，主要分布于我國云貴地區(qū)、四川南部及西藏南部等地。重樓為稀有藥材，具有抗腫瘤、消腫止痛、止血、抗菌消炎和免疫調(diào)節(jié)等作用，對治療癌癥、毒蛇咬傷、跌打損傷、咽喉腫痛和驚風(fēng)抽搐等方面有顯著療效[1～2]。重樓屬我國產(chǎn)23種12變種，目前藥材市場重樓品種混亂，2015年版《中國藥典》收載的重樓(Rhizoma Paridis)為百合科重樓屬植物云南重樓Paris polyphylla Smith var. yunnanensis(Franch.) Hand-Maz.或七葉一枝花Paris polyphylla Smith var. chinensis (Franch.) Hara的干燥根莖[3]。有文獻(xiàn)報道[4～7]，重樓皂苷含量高低與重樓藥材的干燥方式及不同提取方法有一定的關(guān)系。

因此，筆者實(shí)驗首先通過比較回流提取、超聲提取及微波輔助提取方法對重樓皂苷粗品提取率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)回流提取皂苷量較多，方法簡單可行，故試驗選擇回流提取法進(jìn)行操作。由于影響重樓皂苷提取分離的因素較多，所以在單因素實(shí)驗的基礎(chǔ)上，參照相關(guān)文獻(xiàn)[8～9]采用響應(yīng)面軟件Design Expert 8.0的設(shè)計方法，以影響重樓皂苷類提取純化工藝的4個顯著因素(液料比、提取溶劑、提取時間、提取次數(shù))為自變量，重樓皂苷類得率(Y)為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析篩選了最優(yōu)化的甾體皂苷類化合物提取工藝，從而為重樓藥材資源開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器與材料

1.1.1 試驗儀器 高效液相色譜儀(E2695，美國 Waters公司)，超聲清洗器(KQ3200DB，江蘇昆山超聲儀器有限公司)；優(yōu)普超純水機(jī)(UPH-40，成都超純科技有限公司)，電子天平(MS105DU，d=0.01mg，梅特勒-托里多)；循環(huán)真空泵(SKD-Ш，鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RV10，德國IKA公司)；粉碎機(jī)(HL-500A型高速多功能粉碎機(jī))等。

1.1.2 試藥與材料 對照品包括重樓皂苷Ⅰ(HN1116XB13)、重樓皂苷Ⅱ(R22O6F4766)、重樓皂苷Ⅵ(RN1118FA13)、重樓皂苷Ⅶ(111593-200402)、重樓皂苷H(P22J7F9421)、重樓皂苷V(P22J7F9420)和薯蕷皂苷(CA0816CA14)均購于上海源葉生物科技有限公司(所有對照品純度HPLC≥98%), 乙腈為色譜純(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)，甲醇為色譜純(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)，乙醇等試劑均為分析純，水為超純水。供試樣品于2015年8月采集于陜西省漢中市鎮(zhèn)巴縣簡池鎮(zhèn)，經(jīng)陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院楊培君教授鑒定為七葉一枝花Parispolyphyllavar.chinensis(Franch.) Hara的根莖。從所采藥材中選取大小適中的根莖作為供試材料，于50℃干燥，粉碎，過粒徑0.45mm篩，備用。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 Inertsil ODS-3C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫35 ℃，分析時間16 min，進(jìn)樣量20 μL，流動相為乙腈-水(50∶50)，檢測波長為203 nm，流速為1.0 mL·min-1。在該條件下，對照品與樣品的色譜圖，見圖1。

1.2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取105℃干燥至恒質(zhì)量的重樓皂苷對照品適量，用甲醇定容于容量瓶中，使重樓皂苷Ⅶ、H、Ⅵ、Ⅱ、薯蕷皂苷、Ⅰ 和V的終質(zhì)量濃度分別為184，192，184，256，174，184和188μg·mL-1的對照品混合溶液，存于4℃冰箱中供分析使用。

1.2.3 供試品溶液的制備 取經(jīng)干燥的重樓供試樣品，精密稱定2.0 g粉末，置圓底燒瓶中，精確加入乙醇50.0 mL，稱定質(zhì)量，回流提取30 min，再稱定質(zhì)量，用乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，靜置10 min。取上清液過0.22μm濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，存于4℃冰箱中供分析使用。

圖1 HPLC圖

1.2.4 HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 依次精密量取混合對照品溶液 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL，分別移至10mL量瓶中，加甲醇定容，然后用0.22μm濾膜過濾，依次進(jìn)樣20.0μL進(jìn)行色譜分析，測定峰面積。分別以各色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以對照品質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。保留時間、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍(表1)。

表1 重樓對照品回歸方程及相關(guān)系數(shù)

1.3 單因素實(shí)驗

筆者實(shí)驗首先通過比較回流提取、超聲提取及微波輔助提取方法對重樓皂苷粗品提取率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)回流提取皂苷量較多，方法簡單可行，故本試驗選擇回流提取法進(jìn)行操作。由于影響重樓皂苷提取分離的因素很多，所以實(shí)驗分別對提取溶劑、液料比、提取時間、提取次數(shù)四個因素對重樓皂苷得率的影響進(jìn)行逐個考察。

1.3.1 提取溶劑 在參照文獻(xiàn)[10]的基礎(chǔ)上，固定液料比30∶1(mL∶g)，水浴提取溫度(85℃)，提取時間(60 min·次-1)及提取次數(shù)(1次)，分別在下列提取溶劑中提取并進(jìn)行重樓皂苷得率檢測。試驗結(jié)果表明，選擇70%乙醇作為提取溶劑效果較好(表2)。

表2 提取溶劑對皂苷得率的影響

1.3.2 提取前浸泡時間 固定提取溶劑(70%乙醇)，固定液料比30∶1(mL∶g)，水浴提取溫度(85℃)，提取時間(60 min·次-1)及提取次數(shù)(1次)，分別考察在溶劑中冷浸時間為30，60，90，120和150 min的提取效果。結(jié)果表明，選擇浸泡時間為90 min較為適宜(圖2)。

1.3.3 液料比 固定提取溶劑(70%乙醇)，其它條件同(1)項，考察液料比為10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1和60∶1(mL∶g)對重樓皂苷得率的影響。結(jié)果表明，選擇液料比為40∶1(mL∶g)，效果最佳(圖3)。

圖2 浸泡時間對得率的影響

圖3 液料比對得率的影響

1.3.4 提取時間 固定液料比為40∶1(mL∶g)，其它條件同(1)項，分別考察提取時間為30，45，60，75和90 min·次-1對重樓皂苷的影響。結(jié)果表明，選擇提取時間60 ·次-1為最佳(圖4)。

圖4 提取時間對得率的影響

1.3.5 提取次數(shù) 固定提取溶劑(70%乙醇)，固定液料比40∶1(mL∶g)，水浴提取溫度(85℃)，提取時間(60 min·次-1)，分別考察提取次數(shù)為1，2，3和4次對重樓皂苷得率的影響。結(jié)果顯示，選擇提取次數(shù)為2時最佳(圖5)。

圖5 提取次數(shù)對得率的影響

2 響應(yīng)面法設(shè)計

2.1 響應(yīng)面法設(shè)計與結(jié)果分析

根據(jù)上述單因素試驗結(jié)果，采用響應(yīng)面軟件Design Expert 8.0設(shè)計方法，以影響重樓皂苷類提取純化工藝的4個顯著因素(液料比、提取溶劑、提取時間、提取次數(shù))為自變量，重樓皂苷類得率(Y)為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析。因素與水平設(shè)計見表3。結(jié)果見表4和表5。

表3 因素與水平

通過軟件Design Expert 8.0，對表4中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，可得到重樓皂苷得率與主要因素間的關(guān)系方程為：

Y=-2.200+0.057A+1.966B+0.560C+0.030D-1.250E-003AB+3.7503E-004AC+1.500E-004AD-0.030BC-0.011BD+7.500E-003CD-4.431E-004A2-1.029E-004B2-0.169C2-1.085E-003D2。

在試驗設(shè)計范圍內(nèi)，一次項的偏回歸系數(shù)的絕對值B> C > A> D，說明提取時間對皂苷得率影響最大，其次是提取次數(shù)和溶劑濃度，液料比對皂苷提取率的影響最小。

重樓皂苷得率與主要影響因素之間關(guān)系模型后進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5。

表4 響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果

由表2～表5可知，該模型(F=91.02，p<0.0001)極其顯著，模型中失擬項(F=3.69，p=0.1100>0.05)不顯著。上述結(jié)果表明，該模型設(shè)計合理，實(shí)驗方案恰當(dāng)，具有一定的可操作性。

表5 模型的方差分析與顯著性檢驗結(jié)果

注：p值小于0.01為非常顯著；p值小于0.05為顯著；p值大于0.05為不顯著。

2.2 響應(yīng)面交互作用分析

在回歸方程中，交互項AD、BD、CD均有較高的顯著性，此充分表明溶劑濃度、提取時間和提取次數(shù)的交互作用對重樓皂苷類得率有較顯著影響。在二次回歸模型方程基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面繪圖，依次得到比較顯著的三維圖和等高線圖，圖6～圖8所示。其中AD、BD、CD 3個等高線圖呈橢圓形，說明兩因素間交互作用較強(qiáng)，結(jié)果影響顯著。

圖6顯示，響應(yīng)曲面的坡度比較陡峭，表明響應(yīng)值的(重樓皂苷類得率)大小對溶劑百分比和液料比的改變較為敏感。當(dāng)溶劑百分比為70%，液料比30∶1(mL∶g)時，重樓皂苷類的得率達(dá)到最大值。從等高線可以看出，溶劑百分比的變化對重樓皂苷類得率的影響，相比液料比變化對皂苷類得率的影響大。

圖7顯示，響應(yīng)曲面的坡度相對較為陡峭，表明響應(yīng)值(重樓皂苷類得率)對提取時間和液料比的改變較為敏感。隨著提取時間和液料比的增加皂苷類得率呈相應(yīng)增加的趨勢，提取時間為60 min，液料比為30∶1(mL∶g)時，重樓皂苷類得率達(dá)到最大值。從等高線可看出，提取時間的變化對重樓皂苷類得率的影響，相比液料比變化對皂苷類得率的影響大。

圖8顯示，響應(yīng)曲面的坡度相對陡峭，表明響應(yīng)值(重樓皂苷類得率)對提取次數(shù)和液料比的改變甚為敏感。當(dāng)提取次數(shù)為2次，液料比為30∶1(mL∶g) 時，重樓皂苷類得率達(dá)到最大值。從等高線可以看出，提取次數(shù)的變化對重樓皂苷類得率的影響，相比液料比變化的影響大。

圖6 溶劑百分比和液料比交互影響3D分析

圖7 提取時間和液料比交互影響3D分析

圖8 提取次數(shù)和液料比交互影響3D分析

2.3 最佳工藝驗證

綜上所述，采用Design Expert 8.0軟件計算與分析所得，各因素的最優(yōu)條件確定為：提取溶劑70%乙醇，提取前浸泡時間為90 min，液料比30∶1(mL∶g)，提取時間60 min·次-1及連續(xù)提取2次。在最佳條件下，重樓皂苷類得率的軟件預(yù)測值為2.155%。為檢測響應(yīng)面法所得結(jié)果可靠性，采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行重復(fù)試驗，得實(shí)際提取率值為2.094%。與預(yù)測值相比，其相對偏差值為2.83%。因此，基于上述回歸方程可對重樓皂苷實(shí)際提取過程進(jìn)行預(yù)測和控制。

3 結(jié)論

由于產(chǎn)區(qū)、采收季節(jié)不同或種類不同，導(dǎo)致皂苷成分的類別和含量存在差異。筆者曾對15批不同來源重樓樣品基于HPLC測定了7種甾體皂苷的含量，同時構(gòu)建了重樓藥材的HPLC指紋圖譜，其實(shí)驗結(jié)果可用于重樓的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評價[11]。此外，炮制手段和制備方法不同，也會影響重樓的品質(zhì)和藥效。因此，開展重樓品質(zhì)分析與質(zhì)量監(jiān)控，探討重樓有效成分的提取分離工藝，構(gòu)建重樓分析檢測方法等相關(guān)研究具有重要意義。目前，對中藥重樓的皂苷類化學(xué)成分的提取分離研究，文獻(xiàn)報導(dǎo)較多，包括回流提取法、超聲提取法、植物酶提取法、微波輔助提取、超臨界流體萃取(SFE)等[12～16]。其中，前兩種皂苷的提取方法多被采用。盧偉等[17]研究了回流法對重樓皂苷的提取工藝；當(dāng)乙醇濃度為90%、液料比為12∶1、提取時間1 h·次-1，連續(xù)提取2次為重樓總皂苷的最佳提取工藝。筆者研究通過比較回流提取、超聲提取及微波輔助提取等多種方法對重樓皂苷粗品提取率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將重樓根莖切片在50℃烘箱中干燥，粉碎，過粒徑0.45 mm篩子后，以70%乙醇回流提取效果較好。由于影響重樓皂苷的提取純化因素很多，所以實(shí)驗考察了提取溶劑、液料比、提取時間、提取次數(shù)4個因素對重樓皂苷得率的影響；通過響應(yīng)面法設(shè)計，以7種重樓皂苷之和為考察指標(biāo)，優(yōu)化了重樓皂苷的提取工藝過程，最終確定以70%乙醇為提取溶劑、液料比為40∶1(mL∶g)、浸泡90 min、提取時間60 min·次-1及連續(xù)提取2次最佳。按照最佳提取工藝，皂苷的實(shí)際測定值與預(yù)測值基本一致。