SerpinD1的研究進展

王 心，金 海，庹必光

(遵義醫科大學附屬醫院消化內科，貴州 遵義 563000)

絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor,Serpin) 是體內最大的蛋白酶抑制劑超家族，分布于全身組織，其可因分布位置的不同而發揮不同的生物功能[1]。研究表明，Serpin家族成員因構象改變和聚合現象的發生而導致多種疾病[2]，如SerpinB5的突變與腫瘤相關，SerpinI1基因突變與阿爾茨海默病相關等。SerpinD1是Serpin超家族中的重要一員[3]，又稱為肝素輔因子Ⅱ。研究顯示，該基因與凝血系統、血管損傷、炎癥反應、腫瘤等相關[4-5]。在炎癥中，SerpinD1主要是通過基因上的P6位點產生對炎癥細胞的趨化作用，其發揮抗凝血酶作用的條件之一是有肝素的存在。在非小細胞肺癌中，SerpinD1具有促進細胞運動和轉移的作用；且學者預測SerpinD1在非小細胞肺癌中是一種新的轉移增強劑，可作為肝素治療非小細胞肺癌的預測因子[6]。SerpinD1增強了肺癌細胞中的肌動蛋白成核和聚合現象，這與在癌癥治療中使用肌動蛋白或成核因子作為治療靶點的觀點相一致[7]。有研究顯示，SerpinD1還與系統性紅斑狼瘡和類風濕關節炎等疾病有關[8]。現就SerpinD1的研究進展予以綜述。

1 Serpin

Serpin是學者于1980年依據卵清蛋白和人抗凝血酶等蛋白的一級結構的保守性提出[9]。Serpin超家族分布廣泛，可分布在細胞外和細胞內，但兩者的生物功能不同，因作用方式的不同或鉸鏈區的保守性Serpin可分為抑制型和非抑制型[10]。迄今為止，已發現了400多種Serpin超級家族的成員，包括A～P亞型，其中有36個編碼人蛋白質的基因及5個假基因[11-12]。按照系統發育分析，人Serpin家族成員分為9枝(A～I)[13-15]。

天然Serpin是一種亞穩態蛋白，能通過構象改變發揮抑制靶酶的作用，但結構較易發生自發性重排，故稱之為自身聚合現象[16]。這些現象的發生使得Serpin容易發生突變，導致蛋白質錯誤折疊、無活性聚合物的形成等，已證實一些Serpin家族成員因構象改變和聚合導致疾病[2]。Serpin病就是其中的一種。越來越多的研究發現，編碼Serpin的基因發生突變與多種人類疾病有密切聯系，如SerpinA3基因發生突變與肺氣腫相關，SerpinD1的基因突變與血栓的發生有關等[4-5，17]。

2 SerpinD1

SerpinD1是一種單鏈抗凝血酶糖蛋白，其分子量約為65 000[18]。SerpinD1含有480個氨基酸殘基，約30%的氨基酸序列與家族其他成員相似；SerpinD1與家族其他成員最大的區別在于它的N端是一個酸性結構域，氨基酸殘基約80個，其中陰離子酸性氨基酸殘基重復序列是SerpinD1作為極強凝血酶抑制劑的原因之一。在加快糖胺聚糖催化抗凝血酶發揮作用的過程中，SerpinD1的兩個酸性結構域即酸性區-1和酸性區-2的作用不可或缺。

2.1 SerpinD1與炎癥和腫瘤的關系 SerpinD1介導炎癥反應是通過它的P6位點與中性粒細胞釋放的彈性蛋白酶相互作用后使SerpinD1失去抗凝血酶作用，且SerpinD1分解出的N端多肽片段會對炎癥細胞起到趨化作用，從而加重炎癥反應。有學者通過用特定氨基酸取代P6位點中的纈氨酸后發現，這種變異型的SerpinD1基因能在幾乎不影響其本身抗凝血酶作用的基礎上大大降低炎癥反應[18]。如在發生細菌性敗血癥時，中性粒細胞被激活，釋放大量彈性蛋白酶，而這些蛋白酶會與SerpinD1反應，使其發生水解，趨化大量炎癥細胞聚集，加重組織損傷。變異型的SerpinD1在機體發生該病的過程中發揮兩方面的作用，既可以抑制抗凝血酶活性的減弱，從而緩解抗凝和凝血過程的失衡；也可以抵抗彈性蛋白酶的水解作用，且變異型的SerpinD1抑制炎癥反應的效果是野生型的10倍，因此在臨床中具有廣泛的應用前景[18]。

癌細胞的異常增殖和遠處轉移是個十分復雜的過程。與正常機體形成的每個組織均由固定數量的細胞構成且具有精準的秩序相比，癌細胞會根據周圍的環境來決定自身是否需要分裂、增殖。細胞死亡的同時會有同樣數量的細胞生成，一旦由新分裂產生得到的新細胞數量超過死亡細胞，就有可能導致腫瘤的發生。有文獻報道，腫瘤某種特定的生物學行為使得正常的凝血、抗凝和纖維蛋白溶解系統之間失去平衡，導致腫瘤組織的局部抗凝、纖維蛋白溶解作用明顯弱于促凝作用，使得纖維蛋白在腫瘤的局部不斷沉積，從而導致腫瘤對機體的免疫殺傷無反應[19]。因此，研究腫瘤發生發展與SerpinD1抗凝作用之間的關系，切斷疾病發生的重要環節，恢復凝血與抗凝的平衡，對腫瘤的治療具有重要意義。

有研究者在癌癥基因組解剖學項目中通過對基因表達數據庫的序列進行分析發現，SerpinD1在非小細胞肺癌中表達量高；且進一步深入研究發現，在非小細胞肺癌中SerpinD1具有促進細胞運動和轉移的作用[16]。在非小細胞肺癌中，細胞的存活、生長和遷移是SerpinD1通過Rho鳥苷三磷酸酶的兩個成員Rac1和Cdc42來調節[20]。但SerpinD1刺激這兩者的活性可被磷脂酰肌醇-3-激酶抑制劑LY294002所抑制。這證明了，磷脂酰肌醇-3-激酶是SerpinD1的下游效應器，并作用于Rac1和Cdc42的上游。在Serpin超家族中，SerpinB1參與了肝癌的發生發展，且具有促進肝癌細胞轉移的作用[21]。肝癌死亡的主要原因為5年生存率較低，死亡人數約10余萬人/年[22]。

肝癌的發生發展與多種抑癌基因的失活及癌基因的過度激活密切相關[23]。目前肝癌治療仍以手術為主，放療和化療為輔，但因肝癌缺乏特異性癥狀和體征，發現時已是晚期，即使采取積極治療措施，預后仍較差，多數患者因腫瘤轉移及復發致死。所以，進一步尋找更多與肝癌發生發展相關的基因是目前迫切需要解決的問題[24]。肝癌惡性程度高、難發現、進展快、預后差，是由于肝癌細胞增殖快且具有高度血管侵襲及肝內外轉移的特點[25]。因此，尋找細胞侵襲轉移相關蛋白與肝癌進展的相關性是目前的研究重點之一。由于SerpinD1 在肺癌中有促進腫瘤轉移及侵襲的特點，且其主要由肝臟合成，所以可以從細胞水平、功能學試驗、建立肝癌動物模型去探討SerpinD1在肝癌發生發展中的作用，進一步了解該基因功能結構改變與肝癌發生發展及惡性程度之間的關系，明確SerpinD1在肝癌中是否具有促增殖、侵襲轉移的作用。

2.2 SerpinD1與凝血系統和血管損傷的關系 抗凝血酶-Ⅲ(antithrombin-Ⅲ,AT-Ⅲ)和SerpinD1均是Serpin超家族成員，當病變促發異常凝固時，它們會發揮一定的抗凝作用，并能很好地調節血液纖維蛋白溶解系統。有研究對SerpinD1的免疫化學特性及其交叉免疫電泳圖進行分析表明，在免疫化學特性方面SerpinD1與AT-Ⅲ存在異質性[26]。在肝素存在條件下，SerpinD1通過以共價鍵方式與凝血酶活性中心絲氨酸殘基的羥基形成1∶1的穩定復合物，使凝血酶失去水解蛋白酶的作用；但由于SerpinD1需在血管外發揮作用，所以與AT-Ⅲ相比，其抗凝作用比較專一[26]。此外，SerpinD1與肝素的親和能力較低，達到同樣的抗凝能力所需的肝素水平遠高于AT-Ⅲ，但若肝素水平繼續升高，SerpinD1的抗凝血酶活力并不會提高。

肝素是SerpinD1發揮抗凝血酶作用的條件之一，而使其活化的另一個重要輔因子為硫酸皮膚素。它的適量存在可以使SerpinD1的抗凝血酶效果明顯增強，能使抗凝反應加快1 000倍[18]。有文獻報道，在硫酸皮膚素的特定部位選擇性結合硫酸基團，即可成為SerpinD1激動劑，這種激動劑能夠增強SerpinD1的催化活性，且較SerpinD1有更高的可溶性和特異活性。SerpinD1激動劑對病理狀態下的血管內皮增生具有抑制作用，也能作用于黏附在血管內皮表面的凝血酶，但其治療動脈粥樣硬化需進一步研究。有文獻報道，SerpinD1的活性與內皮血管舒張功能呈正相關，且血漿SerpinD1活性可作為疑似冠心病患者未來心血管事件的預測因素[27]。此外，SerpinD1在白細胞彈性酶降解后釋放白細胞化學誘肽，會促進血管生成以應對貧血[28]。

在人身體的不同部位均存在抗凝血系統，AT-Ⅲ和SerpinD1均主要產生抗凝血作用。在人體血漿中，AT-Ⅲ的存在抑制了血栓的形成。當AT-Ⅲ賴氨酸殘基與肝素共存時，AT-Ⅲ參與滅活凝血酶的速度加快，可見肝素對提高AT-Ⅲ活性有一定作用[29]。在AT-Ⅲ功能正常的情況下，SerpinD1缺陷對血栓形成幾乎沒有影響。但有研究者將人體不同組織中的SerpinD1和AT-Ⅲ水平進行對比發現，SerpinD1在肝組織內占優勢，而在胎盤組織內SerpinD1/凝血酶和ATⅢ/凝血酶的水平相當[30]。且SerpinD1在腦組織、肌肉組織、肺組織、內分泌組織(甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺)、腎臟、膀胱、大部分女性生殖系統中的水平較低，在肝組織中含量豐富[31]。可見，SerpinD1的表達具有組織特異性，其需在特定組織內接受相應的刺激才能發揮對凝血酶的調節作用，也能在特定的病理環境下因所受到的刺激發揮作用。因此，對SerpinD1的研究有助于認識其參與凝血及血栓形成的過程，為藥物的選擇和疾病的治療提供參考。在臨床抗凝治療中，為了有效降低血栓性疾病的發病率，血漿中AT-Ⅲ和SerpinD1水平的有效檢測具有重要意義[8]。研究顯示，檢測血漿SerpinD1水平的方式主要有兩種：SerpinD1活性檢測和SerpinD1的抗原水平測定[26]。

2.3 SerpinD1與其他疾病的關系 有實驗證明，培養的人肝細胞能夠合成SerpinD1[32]。在肝病情況下，SerpinD1水平降低。Tollefsen和Pestka[33]觀察到8例無彌散性血管內凝血肝功能衰竭患者的SerpinD1 水平降低，且與血清白蛋白水平降低呈正相關，提示SerpinD1的合成與肝臟相關。Tran和Duckert[34]報道的7例彌散性血管內凝血患者中有6例患者的SerpinD1抗原水平及活性均降低，且SerpinD1水平的降低與AT-Ⅲ水平的降低呈正相關。但彌散性血管內凝血時SerpinD1水平的降低機制尚不清楚，是否與SerpinD1繼發性消耗增加有關有待進一步研究。有研究顯示，SerpinD1在1型糖尿病與2型糖尿病的活性不一樣，它在1型糖尿病中的活性低，且有高凝和低纖維蛋白溶解狀態，與1型糖尿病患者發生的心血管病變具有相關性；而SerpinD1在2型糖尿病中的活性并沒有改變，其具有高凝狀態，但沒有低纖維蛋白溶解狀態[14]。有研究提示，系統性紅斑狼瘡和類風濕關節炎患者可能有凝血-抗凝血失衡，且他們的SerpinD1和AT-Ⅲ的水平均較正常低，提示 SerpinD1和AT-Ⅲ可能參與了系統性紅斑狼瘡和類風濕關節炎患者的凝血-抗凝血過程[9]。另外，SerpinD1還可作為妊娠高血壓綜合征高凝狀態判斷的分子標志物[18]。

3 小 結

Serpin與多種疾病密切相關，該家族成員的基因多態性在不考慮客觀因素條件下在國內外尚未出現較為統一的結論，因此成為研究熱點。目前，針對SerpinD1生物學特性及結構與功能的研究較多，但對相關臨床應用的研究較少。未來，是否可以通過對SerpinD1的敲除、抑制或過表達來深入了解它的生物學功能，并分析其表達異常與疾病發生發展之間的關系，找出與SerpinD1相關的通路，進一步揭示疾病的分子發病機制，從而為臨床診斷疾病和判斷預后提供理論依據。