微RNA在缺血性腦卒中的作用

汪普求,謝芬高，文航華，曹 俊，張希洲

(三峽大學人民醫院 宜昌市第一人民醫院急診醫學科，湖北 宜昌 443000)

腦卒中是一種急性腦血管疾病，又名卒中、腦血管意外，由于腦部血管突然破裂或血管阻塞導致大腦嚴重缺血缺氧而引起腦組織損傷，并出現一系列臨床表現，如額紋消失、口角歪斜、吐詞不清、一側肢體癱瘓、感覺異常等，包括缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)和出血性腦卒中(hemorrhagic stroke，HS)，其中以IS最為常見，占腦卒中總數的60%～70%,是世界范圍內致死和致殘的主要原因之一[1]。微RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼單鏈RNA小分子，由22～24個核苷酸組成，主要存在于真核細胞中，參與真核生物轉錄后基因表達調控[2]。miRNA是內源性表達的RNA分子，在調控IS的病理生理過程中起重要作用。研究發現，miRNA在促進血管生成、神經形成和神經保護等方面可能具有重要作用，一些miRNA及其靶基因被認為參與神經損傷修復[3]。miRNA最初從基因組DNA中轉錄，而RNA聚合酶Ⅱ負責初級miRNA的轉錄。miRNA的生物學功能非常依賴細胞背景，故miRNA與腦卒中之間的確切聯系應該只在特定的細胞環境中討論。有研究表明，miRNA在腦缺血和相關疾病的分子過程中充當關鍵介質作用[4]?，F對miRNA在IS的作用予以綜述。

1 IS的病理生理學改變

IS的病理生理學機制較為復雜，尚未完全清楚。目前研究較為明確的機制主要是缺血性興奮性毒性、相關的氧化應激、炎癥反應和細胞凋亡。當大腦供血障礙時，腦組織出現供能及供氧障礙，腦細胞進行無氧代謝并產生大量乳酸，過多的乳酸堆積導致代謝性酸中毒，最終導致腦細胞壞死。細胞缺氧及能量和ATP生成不足，Na+，K+-ATP泵功能異常，一方面，因細胞內外離子及水平衡失調，細胞內Na+增多、水鈉潴留而出現細胞水腫；另一方面，可出現興奮性神經遞質(谷氨酸)釋放并激活相關受體，產生缺血性興奮性毒性作用，最終導致腦細胞死亡[2]。線粒體是細胞產能的主要細胞器，腦缺血時，機體產生過多氧自由基，并激活促分裂原活化的蛋白激酶信號通路，進而出現線粒體功能障礙，氧化呼吸鏈中關鍵酶活性降低，氧化呼吸鏈中斷，導致產能不足，最終出現腦細胞能量匱乏而死亡。

2 miRNA在干預IS中的作用

近幾十年，腦卒中的臨床診斷方法主要以CT、磁共振成像、腦血管造影、超聲等影像學檢查為主，其特異性和區分急性腦卒中及其相關危險因素的能力尚不清楚，診斷和判斷預后的能力有限且成本較高。腦卒中溶栓治療時間窗(6 h內)的限制使人們不斷探索新的可用于早期診斷及治療腦卒中的生物標志物。研究表明，miRNA有望成為符合要求的生物標志物[3]。目前，已經發現一些miRNA可用于IS的診斷及預后判斷。

2.1miRNA與缺血性興奮性毒性 缺血性興奮性毒性指組織在缺血后興奮性神經遞質,如谷氨酸、N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)等產生過多，造成神經細胞死亡。IS最初腦組織損傷是由于缺血性興奮性毒性導致的。谷氨酸是中樞神經系統中含量較高的最具代表性的興奮性神經遞質。IS早期，谷氨酸與突觸后非NMDA受體結合，引起Na+通道開放，大量Na+內流，同時伴隨Cl-和水內流，進而出現神經細胞腫脹、溶解，甚至變性壞死。此外，谷氨酸與NMDA受體結合，Ca2+通道開放，大量Ca2+內流，細胞內Ca2+超載，激活相應的Ca2+依賴型酶類及磷脂酶類，進而導致細胞膜性結構破壞，最終導致細胞死亡。

星形膠質細胞谷氨酸轉運體1(glutamate transporter 1，GLT-1)負責大部分細胞外谷氨酸的清除，對預防大腦缺血性興奮性毒性具有重要作用[5]。體外實驗發現，抑制miR-124a表達可顯著降低GLT-1表達水平，使腦組織谷氨酸水平增加，間接說明miR-124a參與腦缺血性興奮性毒性作用調節[6]。動物實驗證明，miR-29a、miR-181a在星形膠質細胞中含量較高且能調控GLT-1表達，能通過特殊的靶基因作用于一些重要的細胞生存/死亡通路，保護IS所致的神經細胞損傷[7-8]。過量的谷氨酸通過激活突觸外NMDA受體亞基1/NMDA 2B亞基和代謝型谷氨酸受體1，導致鈣超載和細胞死亡[9]。過量表達的miR-223減輕NMDA誘導的Ca2+內流，保護IS所致海馬神經元興奮性神經細胞死亡[10]。此外，還有一些miRNA參與缺血性興奮性毒性的調節，如miR-125b、miR-263a、miR-194等通過減少突出間隙谷氨酸的積累、抑制離子通道的開放等減輕缺血所致的興奮性毒性作用。

2.2miRNA與缺血性氧化應激 氧化應激參與機體許多生理病理過程，氧化應激性損傷是缺血性腦損傷和神經細胞死亡的基本機制之一。核轉錄因子2(nuclear transcription factor 2，Nrf2)/血紅素氧合酶1(heme oxygenase 1，HO-1)是目前研究較多的信號通路，在調節機體氧化還原反應平衡方面具有重要作用，同時也是腦組織缺血/再灌注損傷細胞防御氧化應激的重要機制之一[11]。超氧化物歧化酶是一種內源性抗氧化酶，可快速有效滅活超氧陰離子，減輕組織損傷，有助于促進IS再灌注損傷的恢復。谷胱甘肽是機體內重要的小分子肽物質，具有抗氧化和清除氧自由基的作用。目前已發現多種miRNA直接或間接參與Nrf2信號通路的調節，miR-93拮抗劑通過激活Nrf2/HO-1抗氧化信號通路減輕缺血性腦組織損傷[12]。miR-210能提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽水平參與調節IS時的氧化應激反應，從而減輕腦組織損傷[13]。腦缺血時，環加氧酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)可促進活性氧類的產生。正常情況下，COX-2表達量很少，腦缺血可誘導COX-2在神經細胞中的表達。已有研究發現，miR-146a能抑制COX-2在神經系統疾病中的表達[14]。動物實驗表明，miR-424的過度表達能保護短暫性局灶性腦缺血/再灌注損傷，同時抑制過氧化氫誘導的氧化應激造成的細胞損傷[15]。miRNA通過改變相關酶類表達，從而起到保護或促進缺血性腦損傷作用，使miRNA可能成為潛在的用于改善IS后氧化應激的新型治療藥物。

2.3miRNA與缺血后炎癥反應 炎癥反應是IS病理生理過程的重要環節之一。缺血性腦損傷的炎癥反應由多種細胞、炎性因子、趨化因子、活性氧類、損傷相關分子模式、自身抗體等共同參與[16]。研究表明，miR-424能抑制小膠質細胞活化，從而保護缺血性腦卒中所致的神經組織細胞損傷[17]。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是由小膠質細胞和星形膠質細胞表達,能激活核因子κB信號通路，進而促進促炎基因、細胞因子和黏附分子的表達。目前，已發現多種TLR，并且發現TLR4信號通路參與缺血后炎性損傷的調節。TLR4是小膠質細胞中miR-181c的直接作用靶點，可下調TRL4的表達，此外，miR-181c還可抑制核因子κB的活化以及促炎因子的產生[18]。miR-155通過上調TLR4表達同時抑制炎性介質(細胞因子信號轉導抑制因子1、髓系分化初級反應基因88)表達,從而促進腫瘤壞死因子α和白細胞介素1β表達[19]。還有一些miRNA參與腦缺血后炎癥調控，如miR-146a、miR-106a、miR-124、miR-9和miR-219等，通過改變其表達水平調節相應的炎性因子表達，起到促進或抑制炎癥反應作用。

2.4miRNA與缺血細胞凋亡 凋亡、壞死和壞疽是IS發病的3種細胞死亡類型。細胞凋亡是基因控制下細胞自主有序的死亡，有助于維持機體內環境的穩定，在某些病理情況(如卒中)可加速細胞凋亡。細胞凋亡機制復雜，涉及一系列的基因激活、表達等，其中有許多信號通路及化學途徑參與，如膜蛋白受體通路(Fas/FasL)、胱天蛋白酶(caspase)途徑。氧葡萄糖剝奪/再灌動物實驗模型表明，Fas是miR-25作用靶點，且miR-25能抑制Fas/FasL途徑活化，從而減輕腦卒中后細胞凋亡[20]。caspase-3在細胞凋亡中起不可替代的作用，其表達量增加可促進細胞凋亡。動物研究發現，miR-99a抑制cspase-3前體蛋白表達及caspase-3的活化，同時預防IS后的神經細胞凋亡[21]。miR-let-7c-5p能抑制caspase-3表達，從而減少腦缺血所致細胞凋亡[22]。B細胞淋巴瘤/白血病2(B cell lymphoma/leukemia 2，Bcl-2)基因可以抑制由多種細胞毒因素引起的細胞死亡。miR-9能特異性調控Bcl-2l11表達，從而減少細胞凋亡[23]。Bcl-2和Bcl-xL蛋白是減輕缺血后細胞凋亡和細胞死亡的關鍵調節因子。急性缺血性腦卒中后，miR-106b-5p表達量明顯增加，并直接作用于髓細胞白血病1蛋白。髓細胞白血病1蛋白是Bcl-2家族成員之一，是DNA損傷后調控細胞凋亡關鍵因子[24]。組蛋白去甲基化酶10是一種抗凋亡因子，其表達受miRNA調控，急性IS時，miR-146a表達量顯著下降，miR-146a能顯著上調組蛋白去甲基化酶10表達，從而減少神經細胞凋亡[25]。熱激蛋白(heat shock protein，HSP)A12B是HSP70家族成員之一，參與缺血后神經組織凋亡的調控[26]。有報道miR-134在IS中起重要作用，可負向調控HSPA12B誘導的細胞凋亡[27]。此外，還有一些miRNA參與缺血后腦細胞凋亡的調控，如miR-323、miR-9、miR-124、miR-497等均通過改變其表達量參與細胞卒中后腦細胞凋亡。

2.5miRNA在腦卒中的潛在治療作用 IS發病率居高不下，且呈年輕化趨勢，針對IS的治療藥物十分有限，最有效的治療藥物主要是重組組織型纖溶酶原激活劑[28]。而重組組織型纖溶酶原激活劑只適用于急性IS的溶栓制劑，治療時間窗短，一般只用于IS發病6 h內，因此僅適用于10%的IS患者。溶栓治療存在許多局限性和不良反應，其中主要不良反應是可增加出血風險，故需要挖掘其他可用于治療IS的新制劑。miRNA是一種能調控機體某些潛在有毒基因表達的內源性分子，故可作為一種潛在用于治療IS的生物制劑。miRNA參與神經保護、促進神經形成、血管生成等基因的表達，從而促進IS患者腦組織損傷修復，降低病死率，提高遠期生存質量。

2.5.1神經保護作用 水通道蛋白4是中樞神經系統中重要的通道蛋白。IS發作時，水通道蛋白4表達量增加，使大量水通道開放，過多水分子進入細胞內，導致腦細胞水腫，最終出現細胞死亡。研究發現，過度表達的miR-29b能抑制水通道蛋白4的表達，從而縮小腦梗死面積，減輕腦水腫，減輕血腦屏障損傷[29]。動物實驗表明，抑制miR-497的表達，使腦缺血區Bcl-2及Bcl-W蛋白表達量增加，從而減輕IS，減輕神經系統損傷，間接起到保護神經組織的作用[30]。腫瘤壞死因子作用因子3已被證實為缺血性級聯信號中央調制器，包括神經元死亡、神經細胞凋亡、炎癥和氧化應激[31]。有實驗表明，miR-455通過抑制腫瘤壞死因子作用因子3表達，減輕大腦中動脈閉塞所致的神經元細胞缺血缺氧性的腦組織損傷[32]。此外，其他miRNA(miR-181a、miR-21、miR-347、miR-124等)通過相應的途徑直接或間接參與缺血后神經保護，故這些miRNA有望成為潛在的診斷IS的生物標志物和治療腦缺血的生物制劑。

2.5.2神經形成 神經系統功能的維持依賴結構的完整性，同時其增殖、分化、發育需多種重要物質參與，其中神經營養因子是重要小分子物質之一。血管內皮生長因子是一種促進血管生成的神經形成營養因子，IS過度表達的miR-210能上調血管內皮生長因子表達，進而誘導成年小鼠腦內神經形成[33]。miR-124a通過激活Notch信號通路促進缺血后神經形成[34]。其他一些miRNA也參與神經形成，如miR-9可促進人類神經祖細胞的增殖，miR-17-92通過糖皮質激素信號通路影響神經形成，可見，miRNA的藥理調控作用可能是缺血后神經形成的潛在機制。

3 小 結

miRNA在IS的病理生理過程、診斷及潛在治療效果等方面均發揮重要作用，使基于miRNA的新型生物制劑具有很大的應用前景。目前，miRNA的研究多停留在動物水平，如何成功將其轉化為人體水平的研究仍是一大難題。針對miRNA靶向劑的研發仍面臨較多困難，譬如,如何維持其在體內的穩定性、藥動學、定向有效組織分布等。隨著研究的不斷深入，期待miRNA靶向劑能順利生產并更好地應用于臨床，挽救更多患者的生命。