自噬在膿毒血癥中的作用研究進(jìn)展

吳 澤，付 斌，符策崗

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院 海口市人民醫(yī)院急診科，海口 570208；2.上海市第六人民醫(yī)院 海口市骨科與糖尿病醫(yī)院骨科，海口 570300)

膿毒血癥是一種可以導(dǎo)致嚴(yán)重多器官功能障礙綜合征的致死性臨床疾病。雖然關(guān)于其治療在抗生素治療、呼吸機(jī)管理、復(fù)蘇策略和血糖維持等方面取得了一定進(jìn)展，但嚴(yán)重膿毒血癥仍是重癥監(jiān)護(hù)病房的主要死亡原因[1]。在抗生素時(shí)期，膿毒血癥被定義為病原體引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征。然而，近年來(lái)膿毒血癥被定義為由宿主對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)引起的威脅生命的器官功能障礙[2]。據(jù)調(diào)查，多器官功能障礙在膿毒血癥患者并發(fā)癥中占40%～60%[3]，傳統(tǒng)的抗感染治療和支持治療旨在改善膿毒血癥誘導(dǎo)衰竭器官的功能，但治療效果不佳[4]。以往研究認(rèn)為，膿毒血癥引起的組織器官損害可歸因于炎癥反應(yīng)的過度活化[5]、免疫功能紊亂[6]和凝血功能障礙等[7]。在膿毒血癥誘導(dǎo)的多器官功能障礙中可伴有自噬的改變，并對(duì)疾病產(chǎn)生一定的影響。在脂多糖或盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)誘導(dǎo)的膿毒血癥中，自噬發(fā)揮著雙重作用，其在早期促進(jìn)細(xì)胞和組織的生存，晚期發(fā)揮損傷作用。現(xiàn)就自噬在膿毒血癥中的作用研究進(jìn)展予以綜述。

1 細(xì)胞自噬概述

自噬通常可分為選擇性自噬和非選擇性自噬。非選擇性自噬是一種進(jìn)化上保守的細(xì)胞質(zhì)降解系統(tǒng)，其內(nèi)的各種物質(zhì)被雙膜結(jié)構(gòu)-自噬體隔離，隨后運(yùn)送至溶酶體進(jìn)行降解，以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。但非選擇性自噬需要受體蛋白識(shí)別后才能降解各種物質(zhì)，如通過線粒體自噬方式回收損傷或功能不全的線粒體。在饑餓、活性氧類聚集及各種微生物等刺激下，自噬水平的失衡容易導(dǎo)致細(xì)胞器的破壞，能量代謝紊亂，最終引起細(xì)胞死亡和凋亡[8-9]。目前，酵母的遺傳學(xué)研究已鑒定出30多個(gè)自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene,Atg)，在自噬過程中，Atg以高度調(diào)節(jié)的方式按順序連接。這些Atg可組成包括Atg1/unc-51樣激酶起始復(fù)合物、Ⅲ類磷脂酰肌醇激酶成核復(fù)合物、磷脂酰肌醇-3-激酶結(jié)合Atg18/Atg2復(fù)合物、Atg5-Atg12偶聯(lián)體系和Atg8/微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain,LC3)-磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)體系在內(nèi)的5種官能團(tuán)，它們參與自噬體的啟動(dòng)、形成、伸長(zhǎng)和融合[10]。自噬始動(dòng)于Atg1/unc-51樣激酶復(fù)合物的活化與分離膜。然后，通過活化Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合物、Atg14和Beclin-1等形成雙層膜結(jié)構(gòu)-隔離膜。在哺乳動(dòng)物中，分離膜主要起源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸部位，也可起源于包括高爾基體、內(nèi)質(zhì)體和質(zhì)膜在內(nèi)的其他部位。Atg5-Atg12復(fù)合物與Atg16結(jié)合可將分離膜擴(kuò)展為自噬體膜，隨后LC3和γ-氨基丁酸受體相關(guān)蛋白家族成員與磷脂酰乙醇胺結(jié)合并募集到膜中。Atg4B和Atg7，LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺結(jié)合促進(jìn)LC3-Ⅱ形成，這種脂類共軛形式的LC3通常用作自噬體標(biāo)志物。最終，自噬體與溶酶體融合，內(nèi)容物降解，有用成分被回收或用于代謝途徑[10-11]。

2 自噬與膿毒血癥

膿毒血癥誘導(dǎo)的自噬是通過微生物結(jié)構(gòu)中的病原體相關(guān)分子模式與模式識(shí)別受體結(jié)合開始，常見的模式識(shí)別受體包括Ca2+依賴型糖結(jié)合跨膜分子、視黃酸誘導(dǎo)基因1[12]和Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)等，這種結(jié)合反過來(lái)又可以激活不同的細(xì)胞內(nèi)事件，并促進(jìn)LC3-Ⅰ向LC-Ⅱ轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致自噬活性的增加。研究表明，革蘭陰性菌的脂多糖與TLR4結(jié)合后通過促分裂原活化的蛋白激酶/p38信號(hào)通路激活自噬[13]。而磷脂壁酸與TLR2結(jié)合后通過促分裂原活化的蛋白激酶1/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2-促分裂原活化的蛋白激酶3/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1途徑誘導(dǎo)自噬[13]。自噬的異常表達(dá)可直接或間接影響膿毒血癥誘發(fā)的多器官功能障礙。在盲腸結(jié)扎術(shù)后的小鼠體內(nèi)，自噬在術(shù)后初始階段增加，隨后逐漸減弱[14]。在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷模型中，中性粒細(xì)胞自噬水平升高，表明該過程中自噬表達(dá)水平可能受炎癥信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[15]。以上研究說明，自噬對(duì)膿毒血癥誘導(dǎo)的多器官功能障礙有重要的調(diào)節(jié)作用。

2.1自噬與膿毒性肝臟損傷 在各種動(dòng)物膿毒血癥模型中，肝臟自噬誘導(dǎo)水平最高，其次為心臟和脾臟[16]。鈣蛋白酶系統(tǒng)可通過直接裂解包括從自噬體形成到自噬溶酶體降解整個(gè)自噬過程的某些Atg蛋白抑制自噬的發(fā)生，如裂解后的Atg5水平與鈣蛋白酶活化一致是鈣蛋白酶介導(dǎo)的自噬功能損害的表現(xiàn)。盲腸結(jié)扎術(shù)誘導(dǎo)的小鼠膿毒性肝損傷中鈣蛋白酶活性增加，而抑制鈣蛋白酶可以增加自噬，提示這種蛋白酶活性增加可能是膿毒血癥過程中的一種負(fù)性自噬調(diào)節(jié)機(jī)制[17]。有學(xué)者對(duì)缺乏表面活性劑相關(guān)蛋白A1和表面活性劑相關(guān)蛋白D小鼠的肝組織進(jìn)行自噬活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LC3-Ⅱ和自噬體顯著增加，且與野生型小鼠相比，表面活性劑相關(guān)蛋白A1和表面活性劑相關(guān)蛋白D敲除小鼠的生存率明顯升高，表明自噬在膿毒血癥誘導(dǎo)的肝損傷中發(fā)揮保護(hù)作用[18]。另有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在脂多糖刺激后出現(xiàn)漸進(jìn)性肝損傷，4 h后丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶顯著升高，隨著刺激時(shí)間增加，肝組織損傷逐漸加重，6 h后脂多糖成功誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷。在急性肝損傷早期(2～4 h)自噬標(biāo)志物(Atg5、Atg7、Beclin-1、LC3A)表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)；在肝衰竭期，自噬標(biāo)志物表達(dá)水平下降[19]。氯喹是一種自噬抑制劑，其能夠阻斷自噬流，給予膿毒血癥小鼠氯喹后，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平升高，肝組織損傷加重，這進(jìn)一步證實(shí)自噬在膿毒血癥誘導(dǎo)肝損傷中發(fā)揮保護(hù)作用[16]。在早期膿毒血癥中，自噬水平升高在肝細(xì)胞中發(fā)揮保護(hù)作用，而晚期自噬水平下降可能與膿毒血癥時(shí)的肝功能衰竭有關(guān)。

2.2自噬與膿毒性心肌損傷 Sun等[20]研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的脂多糖刺激小鼠后，其心臟中的自噬增加；而在高劑量的脂多糖刺激下，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的活性增加，自噬減少。心臟特異性過表達(dá)自噬基因Beclin-1后，自噬增加，mTOR信號(hào)通路被抑制，心臟功能、炎癥反應(yīng)和纖維化均得到改善。Rubicon是一種自噬負(fù)性調(diào)控因子，其通過抑制Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶C3/Ⅲ型磷脂酰肌醇激酶的活性抑制自噬體的成熟。有學(xué)者用脂多糖刺激Rubicon敲除小鼠發(fā)現(xiàn)，其存活時(shí)間較野生型小鼠長(zhǎng)；超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示，與野生型小鼠相比，Rubicon敲除小鼠在脂多糖刺激12 h后心排血量和自噬明顯增加[21]。AMP活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是一種在細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用的酶，其能夠調(diào)節(jié)心臟中的心肌信號(hào)。脂多糖可促進(jìn)心肌組織AMPK上游調(diào)節(jié)蛋白(蛋白磷酸酶2A和蛋白磷酸酶2Cα)的表達(dá)，隨后AMPK的活化可以改善脂多糖誘導(dǎo)心肌自噬的增加，從而改善小鼠心功能不全，其機(jī)制為通過調(diào)控AMPK/mTOR發(fā)揮作用[22]。此外，Zou等[23]認(rèn)為自噬的削弱可引起心功能障礙并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，脂多糖誘導(dǎo)自噬24 h后心肌細(xì)胞開始發(fā)生凋亡，而給予3-甲基腺嘌呤抑制溶酶體的形成或直接沉默Atg5均可導(dǎo)致脂多糖刺激4 h后即出現(xiàn)凋亡。以上數(shù)據(jù)均表明，自噬的增加可以改善脂多糖誘導(dǎo)的心臟毒性。然而也有研究認(rèn)為，自噬的增加可發(fā)揮損害作用[24]。SD大鼠在脂多糖刺激4 h后，TLR4、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4和LC3的表達(dá)水平顯著升高，且電鏡結(jié)果、紅色熒光蛋白-綠色熒光蛋白-LC3轉(zhuǎn)染結(jié)果均顯示脂多糖刺激后自噬表達(dá)水平升高[24]。肉桂醛是一種從肉桂精油中提取的主要活性成分，研究發(fā)現(xiàn)其可通過抑制TLR4-還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4信號(hào)通路抑制自噬，從而改善脂多糖誘導(dǎo)的SD大鼠心功能不全，表明自噬的減少在脂多糖誘導(dǎo)的心肌損傷中發(fā)揮保護(hù)作用[24]。自噬在膿毒血癥誘導(dǎo)的心肌損傷中扮演雙重角色，其可能與動(dòng)物模型、刺激物的劑量和水平等相關(guān)。

2.3自噬與膿毒性肺損傷 呼吸衰竭通常發(fā)生在膿毒血癥早期，研究表明膿毒血癥早期自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的下降與促凋亡蛋白的表達(dá)增加有關(guān)，自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素可誘導(dǎo)自噬增加，從而減輕細(xì)胞凋亡[25]。Zhang等[26]發(fā)現(xiàn)，脂多糖可誘導(dǎo)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，乳酸脫氫酶釋放增加，細(xì)胞活性降低。當(dāng)自噬受到抑制后，細(xì)胞通透性增加，乳酸脫氫酶釋放得更多且細(xì)胞活性降低更為明顯。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，脂多糖可誘導(dǎo)肺組織水腫，白細(xì)胞浸潤(rùn)和出血，而減少自噬可加重肺組織水腫和白細(xì)胞浸潤(rùn)，提示自噬能夠減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷，其機(jī)制可能與限制肺微血管屏障的損傷有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，一氧化碳通過增強(qiáng)Beclin-1依賴的自噬在膿毒血癥中發(fā)揮保護(hù)作用，而敲除Beclin-1后，一氧化碳的保護(hù)作用受到抑制[27]。羥基酪醇是一種天然多酚類化合物，它通過促進(jìn)自噬緩解脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺部炎癥[28]。可見，自噬在膿毒性肺損傷中發(fā)揮重要作用。4-苯基丁酸鈉鹽是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)抑制劑，其保護(hù)作用體現(xiàn)為通過抑制核因子κB信號(hào)通路抑制脂多糖誘導(dǎo)的肺組織中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和通過作用于絲氨酸/蘇氨酸激酶/mTOR通路抑制自噬，其中自噬對(duì)細(xì)胞生存的影響可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的活化有關(guān)[29]。這些研究提示，自噬對(duì)膿毒性肺損傷發(fā)揮雙重作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

2.4自噬與膿毒性腎損傷 為驗(yàn)證自噬在膿毒性腎損傷中的作用，有研究給小鼠進(jìn)行盲腸穿刺結(jié)扎術(shù)誘導(dǎo)急性腎損傷。電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，膿毒血癥小鼠的自噬溶酶體數(shù)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，24 h后自噬溶酶體數(shù)量減少，自噬流受阻，腎損傷加重；給予雷帕霉素誘導(dǎo)自噬后，腎功能得到改善[14]。研究表明，脂多糖誘導(dǎo)的小鼠腎小管細(xì)胞自噬增加，而氯喹抑制自噬可加重脂多糖誘導(dǎo)急性腎損傷，同樣腎近端小管特異性敲除Atg7小鼠表現(xiàn)為進(jìn)一步惡化的脂多糖誘導(dǎo)的急性腎損傷[30]。替西羅莫司或AMPK誘導(dǎo)自噬增加，可保護(hù)內(nèi)毒血癥小鼠近端腎小管和改善腎功能[31]。Escobar等[32]發(fā)現(xiàn)，AMPK誘導(dǎo)自噬的活化可減少細(xì)胞因子的表達(dá)和內(nèi)皮活化，改善腎功能。以上研究提示，自噬在膿毒血癥誘導(dǎo)的急性腎損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。此外，脂多糖可誘導(dǎo)腎細(xì)胞LC3-Ⅱ、Beclin-1的表達(dá)增加，自噬體數(shù)量增加，而給予3-甲基腺嘌呤可抑制自噬流，減少p65磷酸化，導(dǎo)致泛素化核因子κB抑制劑積累，從而使經(jīng)典核因子κB通路的活化受到抑制，提示自噬減少可以降低脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和改善腎功能，其保護(hù)作用可能依賴于泛素化核因子κB抑制劑的積累[33]。自噬對(duì)膿毒性腎損傷雙重作用的具體機(jī)制尚未清楚，可能與其調(diào)控的眾多信號(hào)通路有關(guān)。

3 線粒體自噬與膿毒血癥

雖然大部分情況下，自噬在膿毒血癥中發(fā)揮保護(hù)作用，但在應(yīng)激或病理狀態(tài)下保護(hù)細(xì)胞的機(jī)制尚不清楚。受損和功能障礙的線粒體不僅可以釋放促凋亡因子(細(xì)胞色素C)，還是活性氧類產(chǎn)生的主要來(lái)源。因此，清除受損的細(xì)胞器和功能失調(diào)的線粒體有助于自噬維持細(xì)胞和組織的生存[34]。sestrin 2是一種應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白，其能使巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)線粒體自噬來(lái)清除受損的線粒體，從而抑制膿毒血癥誘導(dǎo)的核結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族嘧啶結(jié)構(gòu)域炎癥小體的活化。如敲除sestrin 2的小鼠可檢測(cè)到線粒體自噬的缺失，其可引起炎癥小體的過度活化，從而增加膿毒血癥的死亡率[35]。PTEN誘導(dǎo)激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)/Parkin信號(hào)通路是線粒體自噬中較為經(jīng)典的通路，PINK1是一種位于線粒體內(nèi)膜中的蛋白激酶，其通常維持在低水平狀態(tài)，一旦被激活即可招募Parkin(具有E3泛素-蛋白連接酶活性的蛋白)轉(zhuǎn)位至受損線粒體的外膜誘導(dǎo)泛素化，泛素化的線粒體在自噬受體調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)下被自噬囊泡包裹成線粒體自噬體，隨后與溶酶體融合并被水解酶降解[36]。脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性心肌損傷后，血清中的心肌肌鈣蛋白Ⅰ表達(dá)顯著增加，而線粒體膜電位呈下降趨勢(shì)，自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)增加，線粒體自噬相關(guān)通路PINK1/Parkin在脂多糖刺激6 h前顯著增加，隨后表現(xiàn)為下降趨勢(shì)，提示脂多糖誘導(dǎo)心肌損傷的早期，心肌細(xì)胞自噬的活化可能發(fā)生于心肌線粒體內(nèi)[37]。脂多糖誘導(dǎo)線粒體去極化增加肝細(xì)胞線粒體鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅰ的表達(dá)，鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶作為PINK1的激酶，通過作用于PINK1/Parkin信號(hào)通路對(duì)膿毒血癥發(fā)揮正性調(diào)控機(jī)制[38]。以上研究均表明，線粒體自噬在膿毒血癥中扮演重要角色，因此增強(qiáng)線粒體自噬可能成為治療膿毒血癥的一個(gè)重要方法。

4 自噬誘導(dǎo)劑在膿毒血癥治療中的價(jià)值

在膿毒血癥的晚期自噬受到抑制，自噬活性降低與器官衰竭有關(guān)，提示自噬誘導(dǎo)劑可能預(yù)防或治療膿毒血癥[39-41]。Liu等[39]應(yīng)用雷帕霉素處理膿毒血癥小鼠發(fā)現(xiàn)，小鼠海馬體的磷酸化mTOR表達(dá)減少，自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ、Atg5和Atg7表達(dá)增加，p62表達(dá)減少。同時(shí)，雷帕霉素能通過增強(qiáng)自噬改善小鼠膿毒血癥后的學(xué)習(xí)能力，表明雷帕霉素可能是治療膿毒癥所致認(rèn)知損耗的潛在有效藥物。褪黑素是一種內(nèi)源性吲哚胺類激素，它通過誘導(dǎo)自噬增加，從而減少肌酸激酶和肌酸激酶同工酶的表達(dá)，減輕心肌結(jié)構(gòu)破壞，改善心功能[40]。卡馬西平作為一種經(jīng)典抗驚厥藥，其能通過激活自噬降低膿毒血癥誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，炎癥反應(yīng)和肝組織損傷，從而改善肝功能[41]。自噬激活在膿毒癥中的保護(hù)作用機(jī)制尚待闡明，膿毒血癥的潛在治療劑的藥動(dòng)學(xué)或藥效學(xué)需要進(jìn)一步研究，這對(duì)膿毒血癥中的器官靶向治療非常重要。

5 小 結(jié)

膿毒血癥是指由不同微生物入侵機(jī)體后導(dǎo)致的不良免疫反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致多器官功能衰竭和細(xì)胞死亡。雖然關(guān)于膿毒血癥的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究已取得一定進(jìn)展，但由于其發(fā)病涉及機(jī)制眾多且復(fù)雜，故仍具有較高的發(fā)病率和死亡率。自噬參與了膿毒血癥的病理生理過程，在大多數(shù)情況下自噬的活化對(duì)膿毒血癥發(fā)揮保護(hù)作用，自噬誘導(dǎo)劑可改善膿毒血癥誘導(dǎo)的器官損傷。然而也有研究認(rèn)為自噬的活化發(fā)揮損傷作用[24]，因此其具體機(jī)制需進(jìn)一步探討。自噬作為一種細(xì)胞適應(yīng)機(jī)制，在膿毒血癥誘導(dǎo)的多器官功能障礙中發(fā)揮重要作用，未來(lái)其將為膿毒血癥的治療提供新靶點(diǎn)。