外泌體微RNA與腎臟疾病的相關研究

李如夢，周冰倩，王艷秋

(中國醫科大學附屬盛京醫院腎內科，沈陽 110004)

腎臟疾病的種類多、病因復雜、病程長。無論哪種腎臟疾病，在未得到及時治療的情況下均將不可逆的進展為慢性腎臟病或終末期腎臟病。目前，慢性腎臟病和終末期腎臟病是全球的健康問題之一[1-2]。因此，亟需尋找新型有效的臨床治療手段。研究表明，外泌體在缺氧、高糖、高草酸等生化刺激下[3-5]分泌異常，并以自分泌、旁分泌、遠分泌的方式[6-8]將其包裹的信號物質傳送到靶細胞，參與腎臟生理[9]、腎臟細胞損傷和修復、免疫反應以及間質纖維化等病理過程。近年來有研究表明，健康人尿液外泌體中微RNA(microRNA，miRNA/miR)-10、miR-30和let-7 miRNA家族成員豐富，這些外泌體miRNA與腎小管旁分泌調節有關，利用健康人尿液外泌體分別培養腎小管上皮和人集合管細胞發現，人集合管細胞腎臟外髓鉀通道蛋白、血清和糖皮質激素誘導的蛋白激酶1及賴氨酸缺乏蛋白激酶1水平降低；近端腎小管細胞中氨基酸轉運蛋白信使RNA水平降低，其編碼的鈉離子依賴的中性氨基酸轉運蛋白2顯著減少，表明尿液外泌體miRNA能對腎小管轉運體進行旁分泌調節[8]。另外，隨著二代測序技術的不斷發展，有文獻報道健康人和慢性腎臟疾病患者尿液外泌體中的miRNA具有較高的豐度和濃度[10]?，F就外泌體miRNA與腎臟疾病的相關研究予以綜述。

1 外泌體miRNA與腎臟疾病的發生發展

有文獻報道，幾乎所有腎臟的腎單位均能分泌外泌體，因此外泌體在腎臟的生理病理活動中可能扮演重要角色[11]。研究發現，外泌體在腎臟組織破壞和再生中起關鍵作用[12]。外泌體通過將所攜帶的信號物質輸送到相應的靶點參與腎臟損傷修復[13-14]、免疫反應[15-17]以及腎間質纖維化[4,18]等生物學活動。其中，外泌體miRNA在各種常見腎臟疾病(原發性腎炎、急性和慢性腎臟病、糖尿病腎病及狼瘡腎炎等)的發生發展中起重要的調控作用。

1.1外泌體miRNA與原發性腎炎 原發性腎小球腎炎是我國終末期腎臟病的最主要原因，其病理類型包括IgA腎病、微小病變型腎病、局灶節段性腎小球硬化、膜性腎病等。近年來，外泌體在原發性腎小球疾病中的研究不斷增加。有研究表明在IgA腎病患者中，腎小球miR-26a水平明顯低于健康對照者；在自身免疫性腎小球腎炎小鼠的尿液外泌體中，miR-26a水平顯著高于正常小鼠，而miR-26a又主要在足細胞表達[19]。因此，尿液外泌體的miR-26可作為自身免疫性腎小球腎炎中受損足細胞的標志物。在特發性腎病綜合征患兒中，尿液外泌體miR-194-5p、miR-146b-5p、miR-378a-3p、miR-23b-3p和miR-30a-5p的表達水平升高增加，但其在臨床癥狀緩解時顯著降低，其中尿液外泌體miR-194-5p和miR-23b-3p與尿蛋白量呈正相關[20]。也有研究證明，外泌體miR-193a參與局灶節段硬化性腎小球腎炎及膜性腎病發生發展的調控機制[21-22]。另外Min等[23]通過高通量測序發現，IgA腎病患者中有158個尿液外泌體miRNA與健康對照者的差異有統計學意義；他們進一步對測序結果差異最明顯的外泌體miRNA進行大量臨床樣本驗證發現，外泌體miR-29c、miR-146a和miR-205與高通量測序結果一致，表明外泌體中的miR-29c、miR-146a和miR-205可能成為IgA腎病的新型非侵入性生物標志物。以上研究表明，外泌體miRNA在原發性腎小球腎炎的發生發展中扮演重要角色。

1.2外泌體miRNA與慢性腎臟病 多種原因導致的腎臟疾病造成腎臟結構和功能不可逆損傷，最終進展為終末期腎臟病，其中腎間質炎癥和腎間質纖維化是慢性腎臟病的共同病理過程。Abbasian等[24]認為，細胞外囊泡miRNA轉移在慢性腎臟病的炎癥凋亡及腎纖維化病理活動中起關鍵作用。在急、慢性腎損傷動物模型中，血漿衍生的外泌體miRNA濃度和豐度低于血漿總miRNA，經分析血漿衍生外泌體中顯著改變的miRNA與細胞外基質受體相互作用和蛋白O型聚糖合成途徑相關，這表明血漿衍生外泌體miRNA可能參與組織纖維化和腎損傷[25]。Lv等[26]研究發現，慢性腎臟病患者輕度纖維化組的尿液外泌體miRNA水平低于中、重度纖維化組，且miR-29c與估計腎小球濾過率和腎小管間質纖維化有關，其可預測腎小管間質纖維化程度。另有研究表明，腎纖維化患者尿液外泌體的miR-29c和miR-21可以預測腎纖維化程度，且miR-29c與腎小球濾過率和間質相對面積呈顯著負相關[27]。經受試者工作特征曲線及臨床和病理指標的相關性分析發現，miR-29c具有較強的實用價值[27]。Yu等[28]發現，尿液外泌體miR-200b水平在IgA腎病和糖尿病腎病向慢性腎臟病進展的過程中顯著降低，且與腎病纖維化進展呈正相關，表明外泌體miR-200b可作為腎纖維化的生物標志物。此外，miR-16、miR-92a、miR-21、miR-124a在慢性腎臟病患者的尿液外泌體中表達豐富，其中miR-16可作為慢性腎臟病患者尿液外泌體最穩定的內源性參考基因[29]。這表明，外泌體miRNA不僅可作為慢性腎臟病發生發展機制的研究靶點，也可作為慢性腎臟病研究的新型輔助工具。

1.3外泌體miRNA與糖尿病腎病 糖尿病腎病是西方國家導致終末期腎臟病的首要原因。在我國，隨著人們生活水平的提高，糖尿病腎病的患病率也逐年增加。Xie等[30]研究發現，2型糖尿病腎病患者尿液外泌體中有496種miRNA的表達與2型糖尿病患者存在差異。其中，miR-362-3p、miR-877-3p、miR-150-5p表達上調，miR-15a-5p表達下調，經分析這些miRNA可能通過p53、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白和AMP活化的蛋白激酶途徑參與糖尿病腎病的發生發展。此外，與1型糖尿病未累及腎臟的患者相比，1型糖尿病腎病患者尿液外泌體中的miR-155和miR-424表達明顯增加[31]。通過動物和細胞實驗發現，系膜細胞和細胞衍生的外泌體中miR-145水平升高，表明1型糖尿病患者尿液外泌體的miR-130a和miR-145不僅可作為1型糖尿病腎病早期診斷標志物，還可能參與1型糖尿病腎病的早期發病過程[31]。一項研究利用miRNA微陣列技術發現，糖尿病腎病患者尿液外泌體中16種miRNA的表達失調：14種miRNA的表達上調，2種miRNA的表達下調[32]。經驗證表明，尿外泌體miR-320c和miR-6068的表達明顯上調，并與微量白蛋白尿具有相關性[32]。進一步分析發現，miR-320c可能通過靶向血小板反應蛋白1對轉化生長因子-β信號通路產生影響，表明miR-320c可作為2型糖尿病腎病疾病進展的新候選標志物[32]。因此，外泌體miRNA可能在糖尿病腎病的發生發展中具有潛在研究價值。

1.4外泌體miRNA與狼瘡腎炎 狼瘡腎炎是系統性紅斑狼瘡最常見的并發癥，也是我國終末期腎臟病最常見的病因之一，其發病隱匿，預后較差。目前，外泌體miRNA在狼瘡腎炎中的研究逐漸成為焦點。與非活動期相比，狼瘡腎炎活動期患者尿液外泌體中let-7a和miR-21的表達顯著下調；經長期隨訪發現，在發病期間let-7a和miR-21的表達也顯示下調，系統治療后表達增加[33]。另外，狼瘡腎炎患者尿液外泌體miRNA在狼瘡腎炎疾病活動期間明顯增加，其中外泌體miR-146a增加最為顯著[34]。Solé等[35]進一步研究發現，狼瘡腎炎患者的尿液外泌體miR-29c與組織學慢性指標和腎小球硬化程度呈負相關，且miR-29c預測狼瘡腎炎患者慢性程度的靈敏度和特異度分別為94%和82%。另有研究表明，狼瘡腎炎患者尿液外泌體miR-26a的表達水平明顯高于健康對照者[19]。因此，外泌體miRNA可能在狼瘡腎炎的發病和診斷中均有重要意義。

2 外泌體miRNA在腎臟疾病中的臨床應用

外泌體因具有較強的抵抗力，能穩定存在于尿液、血液等各種體液中，故可反映疾病的病理狀態。目前，外泌體在疾病檢測方面已成為研究熱點。外泌體miRNA不僅在腎臟疾病的發生發展中發揮重要調控作用，在腎臟疾病的早期診斷和預后評估方面也有潛在價值。

2.1作為腎臟疾病早期診斷的生物標志物 腎活檢一直是腎臟疾病診斷的金標準，但其在臨床早期診斷應用中也存在很多局限性，常因無法及時確診，導致腎臟疾病患者的預后較差。而尿液和血液來源的外泌體因容易獲得、保存穩定，并能及時反映腎臟疾病的病理狀態，故可能成為腎臟疾病早期診斷的敏感生物標志物。Eissa等[36]發現，外泌體miR-15b、miR-34a和miR-636在糖尿病腎病中的表達顯著增加；經進一步分析發現，這些外泌體miRNA可作為糖尿病腎病的診斷標志物，其靈敏度可達100%。另有學者通過建立糖尿病腎病動物模型發現，糖尿病腎病早期尿液外泌體miR-451-5p和miR-16的表達顯著增加，且與臨床病理指標(包括腎小管間質纖維化和腎小球硬化指數)呈正相關，故尿液外泌體miR-451-5p和miR-16可作為糖尿病腎病進展的早期敏感性非侵入指標[37]。此外，有文獻報道2型糖尿病腎病患者尿外泌體中的miR-133b、miR-342和miR-30a表達水平顯著升高，且與臨床指標(血清肌酐、尿白蛋白肌酐比和估計腎小球濾過率)呈負相關[38]。因此，外泌體miRNA具有早期檢測糖尿病腎病的臨床價值。研究表明，高血壓患者尿液外泌體中miR-146a的表達水平與蛋白尿呈正相關，提示其可作為高血壓早期腎損傷的潛在診斷工具[39]。有學者通過比較腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)癌細胞和近端小管細胞來源的外泌體miRNA的表達水平發現，miR-205可作為ccRCC的潛在生物標志物[40]。文獻報道，外泌體中miR-126-3p與miR-449a或miR-34b-5p的結合可用來診斷ccRCC，其中miR-126-3p和miR-34b-5p相結合能反映出小的腎臟占位性病變，而miR-126-3p和miR-486-5p結合能區分良、惡性病變，這些miRNA在手術后可恢復到與健康人相近的水平[41]。以上研究表明，外泌體miRNA在腎臟疾病早期診斷中具有較高的實用價值，可為臨床疾病檢測診斷研究提供新方向。

2.2作為腎臟疾病預后評估的生物標志物 尿液外泌體miRNA不僅具有早期診斷價值，在腎臟疾病預后評估中也具有一定優勢。Ichii等[42]通過對犬腎臟疾病模型尿液外泌體miRNA進行二代測序發現，尿液外泌體miR-26a和miR-10a/b表達水平顯著降低。此外，有學者通過將BK病毒性腎病患者尿外泌體中BK病毒(BK virus，BKV)-miR-B1-5p、BKV-miR-B1-3p和has-miR-16的診斷值與血漿和尿液中的BKV載量進行比較發現，尿液外泌體BKV-miR-B1-5p和BKV-miR-B1-5p/has-miR-16對BK病毒性腎病具有較高的診斷價值，可作為診斷腎臟移植性BK病毒性腎病的替代標志物[43]。另有研究發現，血清外泌體miR-210在ccRCC晚期轉移的患者中表達上調；受試者工作特征曲線分析表明，其靈敏度和特異度分別為82.5%和80.0%，表明血清外泌體miR-210具有較高的臨床診斷價值；進一步研究發現，外泌體miR-210上調與ccRCC患者處于晚期T階段、高Fuhrman分級和轉移相關[44]。因此，腫瘤組織來源的血清外泌體miR-210可作為ccRCC診斷和預后評估的新型非侵入性生物標志物。另有研究表明，血清外泌體miR-210和miR-1233在不同TNM分期ccRCC患者中的表達水平顯著高于對照者，且在術后明顯降低，故血清外泌體miR-210和miR-1233可作為ccRCC的診斷指標，其中miR-210的靈敏度為70%，特異度為62.2%；miR-1233的靈敏度為81%，特異度為76%[45]。

3 外泌體miRNA在腎臟疾病治療中的前景

外泌體在細胞間信息物質交流和信號轉導方面發揮重要作用。其主要通過旁分泌方式將信號物質傳送至目標靶點發揮作用。近年來，外泌體miRNA在腎臟疾病治療方面的研究日益增多。有研究表明，來源于間充質干細胞并富含miR-let7c的外泌體作用于腎小管上皮細胞，并通過下調單側輸尿管梗阻腎組織的Ⅳ型膠原α1、基質金屬蛋白酶9、轉化生長因子-β1和轉化生長因子-β1型受體來減輕腎臟纖維化，表明間充質干細胞的外泌體可作為腎病的新型治療方式[46]。另有研究表明，外泌體miRNA參與腎臟的免疫反應[47]。在缺氧條件下，低氧誘導因子-1α能刺激腎小管上皮細胞釋放富含miR-23a的外泌體，進而激活巨噬細胞以促進腎小管間質炎癥反應，提示外泌體miR-23a可能成為慢性腎臟病研究的新型生物治療靶點。此外，人臍帶血內皮集落形成細胞衍生的外泌體轉移miR-486-5p通過靶向磷酸酶和張力蛋白同源物，并激活蛋白激酶B來減少缺血性腎損傷，提示人臍帶血內皮集落形成細胞來源的富含miR-486-5p的外泌體可成為急性腎損傷的治療手段[48]。可見，外源性的外泌體所攜帶的信號物質作用于腎臟受損細胞或組織，參與調控腎臟固有細胞損傷修復，為腎臟疾病的治療提供了新思路。

4 小 結

近年來，外泌體中的miRNA因具有膜保護不易降解、易獲得、豐度和濃度高等特點而備受關注。隨著研究人員對外泌體miRNA研究的深入,外泌體miRNA不僅在多種腎臟疾病早期診斷、預后評估方面得到廣泛認可，其在腎臟疾病的治療方面也表現出巨大的應用前景。但外泌體miRNA在腎臟疾病發病和進展中的具體作用機制仍不明確，需進一步研究。未來，根據外泌體miRNA在腎臟疾病中的具體作用機制，并結合早期診斷，針對性地用藥和預防，對延緩腎臟疾病進展和改善患者生活質量具有重要意義。