膿毒癥氨基酸代謝變化及檢測方法的研究進展

熊梓宏，張國英，任興瓊，張 寧，周 芹，盧 賓

(成都市婦女兒童中心醫院兒童重癥醫學科，成都 610091)

膿毒癥是人類死亡的主要原因，也是世界范圍內危重癥救治的難點之一。膿毒癥患者機體出現失控的炎癥反應和自身免疫功能紊亂，常伴隨食欲減退或無法進食，機體蛋白質消耗增加且合成不足，導致繼發營養不良和免疫功能紊亂的概率大大增加[1-2]。目前，在膿毒癥患者集束化治療中，除強調積極抗感染、機械通氣和臟器支持治療外，補充適當的營養物質可以促進患者器官保護和免疫功能改善，縮短膿毒癥患者的住院治療時間，降低死亡率，故營養支持治療得到更多關注，成為膿毒癥治療的研究新熱點[3]。氨基酸作為人體重要的必需營養元素，具有其特有的生理、生化、免疫等功能，氨基酸代謝紊亂的嚴重程度可直接影響膿毒癥患者的預后，因此，研究膿毒癥時重要氨基酸的代謝變化，可指導臨床醫師選擇合適的膿毒癥炎癥急性期靜脈營養支持方案以及氨基酸制劑，為膿毒癥患者提供更精準有效的營養治療方案，及時糾正全身和肌肉蛋白質的損失[4]。現對膿毒癥患者機體重要氨基酸的代謝變化及氨基酸檢測方法的研究進展予以綜述。

1 膿毒癥患者機體中重要氨基酸的代謝變化

1.1谷氨酰胺 隨著膿毒癥的進展，患者常出現免疫功能紊亂，機體產生大量的氧自由基，免疫功能下降和過氧化均可引發機體對感染的反應失調并誘發器官功能障礙。谷氨酰胺是人體含量最豐富的條件必需氨基酸，為淋巴細胞、單核巨噬細胞的分化增殖提供足夠的能源物質，可改善患者淋巴細胞和單核巨噬細胞生成數量以及單核巨噬細胞系統的識別、吞噬和殺菌功能，并促進機體內抗炎癥細胞因子(如腫瘤壞死因子、白細胞介素)的合成等，從而改善患者的免疫功能[5]。正常人體內存在很多重要的抗氧化物質(如谷胱甘肽)，具有保護機體多種蛋白質和酶的結構完整以及維持其正常生理功能的作用。谷氨酰胺是參與谷胱甘肽合成的重要物質。有研究證實，嚴重感染等所致的機體應激狀態下，患者對谷氨酰胺需求量明顯增加，谷氨酰胺攝入不足，使血液及組織內谷氨酰胺水平降低，機體谷氨酰胺池的水平越低，患者膿毒癥危重程度和病死率越高，兩者具有相關性[6]。此外，感染細菌和毒素的腸道黏膜細胞容易出現損傷、破壞，導致腸黏膜吸收和代謝功能減弱，腸道屏障功能破壞，造成細菌和毒素移位，引發內源性感染，使膿毒癥患者病情加重，增加治療難度[7]。谷氨酰胺是參與腸道黏膜細胞代謝的必需營養物質，可促進腸黏膜修復，維持腸道屏障功能穩定[8]。為了維護膿毒癥患者(特別對于合并嚴重燒傷患者)腸道黏膜屏障的完整性、改善免疫狀況、維持臟器功能等，適當添加谷氨酰胺的腸外營養液將有助于促進膿毒癥患者的恢復[9]。但目前是否對所有膿毒癥患者添加谷氨酰胺的腸外營養液仍存在爭議。部分研究認為，添加谷氨酰胺的腸外營養液治療的患者總病死率顯著升高[10]。

1.2精氨酸 精氨酸作為重要的條件必需氨基酸，是機體鳥氨酸循環的重要組成部分，對維持機體氮平衡具有不可替代的作用。精氨酸對巨噬細胞的功能有重要影響，可以提高巨噬細胞的抗原呈遞能力，改善免疫功能，刺激生長激素增加，產生一氧化氮和氨氣，是體內多種小分子復合物的前體，可促進膠原纖維合成，加速傷口修復，具有免疫營養作用，對免疫功能和腫瘤生長具有雙重調節作用[11-13]。膿毒癥患者在應激高分解狀態下，精氨酸利用率下降，進而使體內一氧化氮合酶減少，免疫功能紊亂加重。有研究發現，參與免疫應答的相關細胞(如淋巴細胞、單核巨噬細胞等)在膿毒癥進展過程中出現明顯的數量減少和功能減退，導致機體清除病原微生物的能力明顯下降，甚至引發膿毒癥患者的不良結局[14]。因此，給予膿毒癥患者積極抗感染治療的同時，針對免疫功能障礙的免疫調理治療成為膿毒癥患者綜合治療中必不可少的部分。但精氨酸補劑可能引發血管舒張和低血壓[15]。有研究報道，膿毒癥休克患者補充精氨酸不會造成血流動力學的不穩定，故可對膿毒癥患者補充精氨酸治療，但尚有待研究的進一步證實[16]。

1.3芳香族氨基酸和支鏈氨基酸 人體內凡含有芳香環的氨基酸都屬于芳香族氨基酸，芳香族氨基酸主要包括苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸，支鏈氨基酸包括有亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸。膿毒癥患者尤其合并肝功能損害和肝功能衰竭時，機體對芳香族氨基酸清除能力下降，血芳香族氨基酸水平升高，同時肌肉組織對支鏈氨基酸利用增加，導致血支鏈氨基酸水平降低，最終出現體內芳香族氨基酸與支鏈氨基酸比例失衡。支鏈氨基酸抑制芳香族氨基酸向腦內轉運的作用減弱，使芳香族氨基酸大量進入腦組織。

由于膿毒癥患者肝內酶系統受損不能正常解毒，苯丙氨酸、酪氨酸入腦，經β-羥化酶作用產生與兒茶酚胺遞質(多巴胺、去甲腎上腺素)相似的結構，與兒茶酚胺遞質競爭受體，但不能正常傳導神經沖動的苯乙醇胺和羥苯乙醇胺等假神經遞質，從而抑制正常神經遞質的合成，干擾腦干網狀結構的正常活動，導致機體出現神經精神癥狀和不同程度的意識障礙[17]。膿毒性腦病程度越重，患者意識障礙越明顯，相應的血漿芳香族氨基酸水平越高，均在動物實驗和臨床研究得到證實[18-19]。由此可見，氨基酸水平的變化對膿毒性腦病的發生、進展和惡化起重要作用。已有研究發現，給予有神經系統異常癥狀膿毒癥患者補充支鏈氨基酸治療，可使患者血漿氨基酸恢復平衡，腦病癥狀減輕。對于膿毒癥尤其是合并肝功能損害的患者，若將支鏈氨基酸作為補充腸外營養的能量來源，可改善患者腦功能，起到積極保護作用，并有助于改善臨床結果和生存情況[20]。支鏈氨基酸通過參與胰島素作用、蛋白質合成、線粒體生物發生、炎癥和脂質代謝等信號通路，增強免疫細胞功能，幫助受損免疫系統恢復，改善膿毒癥患者營養狀況和臨床結局[21]。

1.4瓜氨酸 瓜氨酸是一種非蛋白質α氨基酸，具有形成肽鍵的能力，不能通過蛋白質直接分解而生成。腸道是唯一能大量合成瓜氨酸的器官，谷氨酸在體內經過肝臟循環和腎臟近曲小管攝取后，與氨作用生成精氨酸和一氧化氮，從而發揮改善免疫功能、抗氧化、維護肺功能等重要的生理功能。在膿毒癥尤其是膿毒性休克狀態下，患者全身器官血供重新分布，胃腸道常處于低灌注、低氧供狀態，體內大量炎癥介質釋放，極易出現腸道黏膜損傷和腸功能障礙，導致瓜氨酸合成明顯減少[22]。Luiking等[23]的一項對健康人群、普通重癥患者和膿毒性休克患者氨基酸代謝的對比研究發現，膿毒癥患者尤其膿毒性休克患者的血漿瓜氨酸合成水平大幅度下降，與健康人群相比，至少下降56%以上。Hull等[24]對兒童腸功能衰竭進行深靜脈置管后發生導管源性感染的研究發現，血漿瓜氨酸水平越高，導管源性感染發生率越低，由此得出，瓜氨酸水平可以作為判斷發生導管相關性血流感染的獨立影響因素。Piton等[25]對67例多器官功能衰竭患者的研究發現，24 h低血漿瓜氨酸水平與患者28 d死亡率有關。血漿瓜氨酸還可作為膿毒癥急性腸功能障礙的診斷標志物[26]。通過補充瓜氨酸與直接補充精氨酸在非膿毒癥人體和動物模型的藥動學的對比研究發現，直接補充瓜氨酸可獲得更高的血漿精氨酸水平，導致一氧化氮合成增加，可見，更多富含瓜氨酸的氨基酸制劑的出現將對膿毒癥的治療發揮更好的作用[27]。

1.5谷氨酸 谷氨酸是人體血漿和組織中含量最豐富的氨基酸，參與機體氮代謝，是器官和組織間氮轉運的載體，體內多種細胞的代謝氧化燃料，參與細胞信息傳遞，是大多數神經細胞突觸的興奮性神經遞質。膿毒癥時，神經細胞受損，谷氨酸經細胞膜漏出增加，大量谷氨酸被釋放到細胞外間隙，而細胞外高水平谷氨酸最終造成N-甲基-D-天冬氨酸受體數量和活性下調，正常神經元細胞N-甲基-D-天冬氨酸受體途徑的信號傳遞反應受到影響，造成機體出現不同程度腦功能障礙。體外實驗亦表明，細胞外高水平谷氨酸導致離子通道受損，Na+、Ca2+內流，過多水分進入細胞使神經細胞腫脹變性，細胞內Ca2+超載導致細胞壞死等一系列病理損害，這些都是膿毒性腦病的可能發病機制[28]。Koppel等[29]研究發現，危重患者細胞外谷氨酸水平越高，發生驚厥的可能性越大。Ytreb?等[30]對膿毒癥合并急性肝功能障礙的動物實驗發現，肝功能失調時，血漿谷氨酸水平出現相應下降，谷氨酸可作為膿毒癥評價肝功能失調的指標之一。施東偉等[31]的研究發現，膿毒癥急性肝功能障礙死亡組的血清谷氨酸水平顯著下降，合并谷氨酸/谷氨酰胺比例下降。因此，監測血清谷氨酸水平降低情況以及谷氨酸/谷氨酰胺比例變化來評估膿毒癥急性肝功能障礙患者的預后，對臨床有較強的指導意義。

2 氨基酸檢測方法

2.1高效液相色譜法 高效液相色譜法是臨床對血液中氨基酸水平進行檢測的常用方法，主要衍生方式有鄰苯二甲醛法、異硫氰酸苯酯法、2,4-二硝基氟苯法等。鄰苯二甲醛作為快速反應劑，先與帶有仲氨基團的氨基酸反應，然后進行柱前或柱后的液相色譜法檢測，此方法雖然反應速度快，但需要先將氨基酸初步分離，再進行衍生化處理，最后完成紫外線監測，因此干擾因素較多，處理步驟復雜，分析時間長，缺乏特異度，且無法進行某些微量氨基酸定量監測。目前發現幾乎所有構成蛋白質的氨基酸都可分為D-型和L-型兩類。某些微量的內源性D-型氨基酸(如D-天冬氨酸和D-谷氨酸等酸性氨基酸)存在于人體的體液和組織中，有重要的生理功能和疾病標志物作用，成為代謝組學和創新藥物開發的研究熱點[32]。需要特異性和敏感性更高的氨基酸分析方法實現相應的氨基酸代謝組學分析，二維手性高效液相色譜法是近年來改進的氨基酸液相色譜法，可以實現生物樣品中D-型氨基酸分析[33]。

2.2氨基酸分析儀 氨基酸分析儀是目前臨床和科研中較常用的一種氨基酸檢測專用儀器，工作原理是典型的利用柱后衍生檢測方法實現對氨基酸檢測，儀器核心部件為離子交換柱，大多選用磺酸型陽離子樹脂分離柱，離子交換柱首先對樣本進行初步分離，然后通過設定的洗脫程序，用不同離子強度、pH值的緩沖液，按照首先酸性氨基酸，之后中性氨基酸，最后堿性氨基酸的洗脫順序，將受檢標本的氨基酸依次洗脫下來，將洗脫下來的氨基酸與茚三酮反應液在135 ℃的加熱條件下進行反應，最終生成藍紫色物質。氨基酸分析儀利用紫外檢測器分別在570 nm、440 nm對產生的藍紫色物質進行檢測和外標法定量，從而實現對氨基酸的定量檢測[34]。目前，我國應用的氨基酸分析儀有KLA-5型、835-50型、85000型和8000A型。利用氨基酸分析儀進行氨基酸檢測的專一性比較強、靈敏度相對較高、操作方便，完成一次血氨基酸檢測的時間較短，最短可縮至半小時左右，但采取柱后衍生檢測的內外影響因素較多，洗脫程序導致檢測需要時間也較長，故尚不能實現對臨床高靈敏性和高特異性分析的大樣本氨基酸進行檢測。

2.3液相色譜-質譜/質譜聯用 液相色譜-質譜/質譜聯用法是近年來出現的氨基酸檢測新方法，也是未來氨基酸檢測技術的發展趨勢，該方法不采用柱前或柱后衍生的傳統檢測方法，利用揮發性離子對試劑(如七氟丁酸/九氟戊酸等)實現氨基酸直接上機檢測，可成功避免衍生過程繁多的影響因素，與傳統液相色譜、氨基酸分析儀相比，具有更強的抗干擾能力，準確性、敏感性性和重現性更高，但液相色譜-質譜/質譜聯用法成本較高，因此未能廣泛開展。Zoppa等[35]采用高校液相色譜-電噴霧-質譜聯用法技術對新生兒干燥血點氨基酸進行定量或定性分析，該方法不需要衍生化試劑的處理，可以快速實現(10 min內完成)40種氨基酸及同分異構體的分析。目前，臨床也借助液相色譜-質譜/質譜聯用技術實現了對氯氮平中毒患者的快速準確判定，并通過測定乙型肝炎病毒感染者血漿中抗乙型肝炎病毒核苷類似物(恩替卡韋、拉米夫定、替比夫定和替諾福韋)來指導乙型肝炎患者的臨床治療[36]。由此可見，液相色譜-質譜/質譜聯用法可通過快速測定各種樣品中的游離氨基酸，實現對藥物等小分子化合物血藥濃度的監測，為尋找臨床診斷證據和指導調整藥物劑量提供技術支持。

3 小 結

膿毒癥患者機體代謝紊亂的機制復雜。目前，各種氨基酸的生理作用尚不完全明確，且不同氨基酸之間以及氨基酸、糖類、脂肪三大能量物質相互交錯影響，需要進一步研究明確不同氨基酸的生理作用以及膿毒癥不同階段氨基酸的代謝水平變化等。不同氨基酸檢測方法各有優劣，仍需進一步發掘更為準確、快速、全面和經濟的氨基酸檢測方法，以便早期準確地評估和治療膿毒癥患者，遵循個體化原則，補充更準確的營養物質，從而改善預后。