miR-7在結直腸癌中的研究進展

羅 雨，秦安成，黃 海，錢偉峰

(南京醫科大學附屬蘇州醫院普外科，江蘇 蘇州 215000)

結直腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發病率逐年上升[1-2]。對于中晚期結直腸癌患者，現有的治療手段療效一般，因此迫切需要尋找療效更佳的治療方法。為尋找新的、有效的治療靶點，深入研究結直腸癌的發病機制很有必要。近年來，微RNA(microRNAs，miRNA)的出現給結直腸癌的治療、監測及診斷提供了新的方向。人們對miRNAs 在結直腸腫瘤以及相關信號通路中作用的深入研究，為尋找新的、更好的治療方法和靶點提供了依據。

miRNAs是一類長約22個核苷酸序列的非編碼RNA分子，主要通過與蛋白質編碼基因的信使RNA(message RNA，mRNA)配對調節基因的表達[3-5]。miRNA不僅是參與調節正常細胞生長、發育、分化的關鍵基因，同時還與人類疾病，特別是癌癥的發展密切相關。miR-7作為miRNA家族中的一員，不僅參與機體正常組織器官的發育，同時還可作為抑癌基因，其表達失調與多種腫瘤的發生、發展、侵襲以及轉移密切相關[6-8]。現就miR-7在結直腸癌中的表達、功能及信號通路等方面的研究進展進行綜述。

1 miR-7的簡介

miR-7成熟體由23個核苷酸組成[9-10]，其在正常腦組織、胰腺β細胞、心臟組織、皮膚的發育過程及腫瘤中均具有重要作用[11]。miR-7 有miR-7-1、miR-7-2和miR-7-3三種亞型，分別位于基因組的不同位置，但最后的成熟序列均具有相同的生物學活性[12]。miR-7-1位于第9號染色體HNRNPK基因的內含子中，miR-7-2位于第15號染色體的基因間區，miR-7-3位于第19號染色體PGSF1a的內含子中[13]。每個miR-7基因都會產生3個獨特的初級miRNA轉錄產物，分別是pri-miR-7-1、pri-miR-7-2和 pri-miR-7-3。這些初級miRNA轉錄產物通常長度大于1 000 nt，并且包含莖環結構。RNA內切酶Drosha將這些初級miRNA轉錄產物裂解，生成前體miRNAs，稱為pre-miR-7-1、pre-miR-7-2和pre-miR-7-3，其長度約為110 nt，然后被Dicer轉移到細胞質中，在細胞質中去除末端環路，形成一個短的由miR-7-5p和miR-7-3p鏈組成的雙工成熟miRNA。迄今為止，大部分研究集中在miR-7-5p上，通常簡稱為miR-7[14]。

miR-7的調控主要分為轉錄水平調控和轉錄后水平的調控。成熟miR-7表達的調控發生在轉錄水平以及miRNA成熟過程的各個階段。在轉錄水平上，miR-7的表達受多種信號的影響；在轉錄后水平，miR-7通過與靶mRNA的3′非翻譯區(3′untranslated region，3′UTR)結合調控基因的表達。這些相互作用可能會抑制目標mRNA的翻譯和(或)降解[15]。

2 miR-7在結直腸癌中的表達和功能

目前研究認為，miR-7在結直腸癌中的表達是下調的。Wang等[16]采用微陣列平臺在結直腸癌組織中識別出8個差異表達的miRNA，其中miR-7的表達水平明顯降低。此外還發現，miR-7在結直腸腺瘤和結直腸癌中的表達也存在差異，可作為鑒別結直腸良惡性病變的指標之一[16]。Xu等[17]研究發現，與正常結腸黏膜上皮細胞相比，miR-7在多個結直腸癌細胞系(SW620、SW480、LoVo、RKO、 LS174T)中的表達顯著下調。進一步研究發現，除腫瘤組織中miR-7的表達顯著下降外，癌旁組織中miR-7的表達也明顯下降[17]。Zeng等[18]的研究證實，miR-7在結直腸癌組織中的表達明顯低于正常結腸組織，此外，miR-7的表達與淋巴結轉移和腫瘤TNM分期也相關。

miR-7在結直腸癌的發生、發展過程中起著重要作用。體外實驗顯示，當miR-7高表達時對結直腸癌細胞的增殖有明顯的抑制作用；細胞周期實驗顯示，大部分結直腸腫瘤細胞系細胞被阻滯在G1期，從而抑制結直腸癌細胞的增殖[19]。Zeng等[18]研究發現，上調miR-7的表達可抑制結直腸癌HCT-8細胞和Caco-2細胞的增殖和遷移；反之，下調miR-7的表達可增強HCT-8和Caco-2細胞系的增殖和遷移。以上研究表明，miR-7是一種腫瘤抑制因子，在結直腸癌的發生、發展過程中發揮重要調控作用。

3 miR-7抑瘤作用中的相關因子

在結直腸癌信號通路中，miR-7可與多個因子發生作用，從而調控腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移。

3.1miR-7與Yin Yang 1 (YY1) YY1是GLIO-Kruppel家族中一種保守的多功能蛋白，作為轉錄調控因子，通過調控不同基因的表達，參與胚胎形成、細胞增殖、凋亡、DNA修復和分化等多種生物學過程[20]。據報道，YY1在乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、胃癌等多種腫瘤中均異常表達[21]。Zhang等[22]發現，結直腸癌組織中YY1的上調與淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期以及生存期呈正相關。YY1可通過調控p53、Wnt等重要信號通路，誘導細胞增殖、抑制細胞凋亡，從而發揮致癌作用[22]。在此基礎上運用silico搜索發現，YY1 mRNA 3′ UTR序列含有一個進化保守的miR-7結合位點，使用熒光素酶報告分析和Western blot分析證實，miR-7 直接結合于YY1 3′ UTR，負向調控結腸癌細胞YY1蛋白的表達[22]。該研究表明，miR-7可通過調控下游靶位點YY1，從而影響結直腸癌細胞中p53和Wnt依賴的信號通路，以抑制結直腸癌的發生及發展。

3.2miR-7與Paired box 6 (PAX6) PAX6是murine multigene家族成員之一，是一種涉及胚胎發育的高度保守的轉錄因子[23]，在多個系統和器官的發育和功能中發揮關鍵的調節作用，如中樞神經系統[24]、眼[25]、內分泌腺[26]，胰腺[27]等。研究表明，PAX6在惡性腫瘤如膠質瘤[28]、乳腺癌[29]、前列腺癌[30]等中也發揮重要作用。研究發現，與鄰近正常組織相比，結直腸癌中PAX6基因外顯子5的甲基化頻率較高，證明PAX6在結直腸癌中可能發揮作用[31]。Li等[19]發現，PAX6 mRNA 3′ UTR序列中存在miR-7的結合位點，并且PAX6是miR-7的直接靶基因。細胞周期實驗顯示，當miR-7在Caco-2和SW480細胞系過表達時，腫瘤細胞大部分被阻滯在G1期；相反，PAX6過表達的Caco-2和SW480細胞系在G1和G2期的百分比最低，在S期的百分比最高，說明細胞處于快速分裂狀態[19]。以上研究表明，miR-7負調控PAX6，通過調控細胞周期進展，抑制結直腸癌細胞的增殖、轉移和侵襲。進一步研究miR-7和PAX6對結直腸癌細胞增殖和侵襲相關信號通路的影響發現，miR-7和PAX6是通過調控磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B[phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/PKB(Akt)]信號通路和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2及MMP-9蛋白的表達發揮作用的，miR-7通過抑制PAX6的表達抑制PI3K/Akt信號通路，使MMP-2和MMP-9蛋白的表達降低，從而抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲[19]。

3.3miR-7與TYRO3 TYRO3是TAM家族(由酪氨酸激酶TYRO3、AXL以及MERTK組成)的成員，已被證實在包括結直腸癌在內的多種人類腫瘤中異常表達，并與腫瘤進展和靶向治療耐藥性相關[32]。Qin和Qian[33]利用TargetScan、PicTar和miRanda預測miR-7的潛在靶點發現，TYRO3是miR-7的靶基因。為進一步證實TYRO3是否為miR-7的直接靶基因，將TYRO3 3′UTR野生型和突變型與miR-7類似物或miR-7陰性對照共轉染293T細胞，結果顯示，miR-7降低了TYRO3 3′UTR野生型的相對熒光素酶活性，而在突變結合位點中熒光素酶活性未受影響[33]。采用Western blot檢測miR-7類似物轉染對LoVo、SW480和SW620細胞中TYRO3表達的影響發現，miR-7過表達導致結直腸癌細胞中TYRO3的表達顯著下降，此外還發現miR-7的抑制能明顯增加結直腸癌細胞系中PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路的活性，而這種作用可被TYRO3小干擾RNA抑制[33]。由此推斷，miR-7可通過調控TYRO3的表達，影響下游PI3K/Akt/mTOR信號通路，從而影響結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

3.4miR-7與X線交錯互補修復基因2(X-ray repair cross-complementing gene 2,XRCC2) XRCC2位于染色體7q36.1，屬于rad51相關蛋白家族成員之一，參與同源染色體重組以維持染色體的穩定性以及修復DNA損傷。研究表明，XRCC2與結直腸癌的發生相關[34]。Curtin等[35]發現，XRCC2單核苷酸多態性可增加結直腸癌的發病風險。Xu等[17]首先發現，miR-7在結直腸癌細胞系和組織標本中的表達下調，四氮唑鹽比色法和細胞劃痕實驗證實，miR-7過表達抑制結直腸癌細胞的增殖，并誘導細胞凋亡。為了進一步確定miR-7的作用機制，采用TargetScan數據庫預測發現miR-7可作用于XRCC2的3′UTR，熒光素酶實驗證實XRCC2是miR-7的直接靶基因[17]。因此，miR-7可通過靶向XRCC2抑制結直腸癌細胞的增殖，誘導細胞凋亡。

3.5miR-7與黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK) FAK主要分布在細胞質中，引起細胞骨架蛋白的積累和解聚，通過影響細胞黏附站點的結構和膜突起調節細胞的活動，同時促進MMPs分泌，破壞細胞的細胞外基質，加速結直腸癌細胞的增殖，增強侵襲能力[36]。研究證實，FAK與乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌、膠質瘤等相關，與腫瘤的增殖、凋亡、黏附以及遷移顯著相關[37]。Wu等[38]研究發現，在膠質瘤細胞中miR-7通過與FAK mRNA的3′UTR區域結合，抑制FAK的表達，從而抑制膠質瘤細胞的侵襲。據此，Zeng等[18]推測，miR-7也可通過調控FAK的表達在結直腸癌中發揮作用。實驗結果也證實了該推測，在結直腸癌中，miR-7的過表達能顯著降低FAK蛋白的表達；相反，miR-7表達減少可導致FAK蛋白表達增加[18]。因此，miR-7通過靶向FAK蛋白的表達，抑制結直腸癌細胞的增殖和轉移。

3.6miR-7與小腦變性相關蛋白 1 反義轉錄物(cerebellal degeneration-related protein 1 antisense,CDR1as) 環狀RNA是存在于真核細胞中的一種非線性RNA，具有穩定性、特異性以及進化保護性等特性。研究表明，環狀RNA能夠作為miRNA海綿發揮作用，其中CDR1as是miR-7的強海綿，在結直腸腫瘤中發揮重要作用[39]。Tang等[40]研究發現，CDR1as在結直腸癌組織中高表達，CDR1as下調抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲；使用實時熒光定量聚合酶鏈反應發現，在結直腸癌HCT-116和DLD-1細胞系中，下調CDR1as的表達后，miR-7的表達顯著升高，且miR-7表達的升高導致HCT-116和DLD-1細胞的活力顯著下降。為了進一步確定CDR1as表達的降低是否依賴于miR-7發揮作用，將miR-7抑制劑瞬時轉染入CDR1as下調的HCT-116和DLD-1細胞，結果發現，miR-7抑制劑顯著提高了腫瘤細胞的活力和侵襲能力。這些結果表明在結直腸癌中CDR1as與miR-7密切相關。

3.7miR-7與促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotrophin-release hormone,CRH)2/urocortin(Ucn)2 CRH是一個含有41個氨基酸的多肽，是應激時對內部和外部因素反應的主要調節因子。CRH相關肽主要成員有CRH、Ucn、Ucn2、Ucn3，主要通過與CRH受體1 (CRH receptor 1，CRHR1)和CRHR2相結合，刺激垂體前葉釋放促腎上腺皮質激素，從而發揮生理功能[41]。研究表明，CRH相關肽及其受體也存在于腫瘤組織，通過自分泌和旁分泌的形式影響腫瘤的發生和發展，但具體的分子機制還不完全明確。Rodriguez等[42]研究發現，結直腸癌中CRHR2呈低表達，CRHR2表達減少促進了腫瘤的發生、發展，并與腫瘤預后差和遠處轉移密切相關。在此基礎上，為進一步了解CRHR2/Ucn2信號在結直腸癌發生、發展中的作用機制，Pothoulakis等[43]對5對野生型和過表達CRHR2的結直腸癌細胞系(HT29,HCT116,SW620,SW480和DLD1)進行高通量miRNA檢測，結果發現，在所有過表達CRHR2的結直腸癌細胞中，miR-7的表達增加了2倍以上，表明miR-7可能是一個潛在的CRHR2/Ucn2信號靶點，隨后通過實時熒光定量聚合酶鏈反應證實CRHR2/Ucn2信號能夠通過miR-7/YY1/Fas通路抑制結直腸腫瘤細胞的增殖，誘導細胞凋亡。

3.8miR-7與長鏈非編碼RNA (long noncoding RNAs，lncRNAs) lncRNAs的長度大于200個核苷酸，是近年來發現的一類具有調控功能但缺乏蛋白質編碼能力的新型基因。lncRNAs屬于調節性非編碼RNA，在細胞的生長發育過程中發揮重要作用，包括X染色體失活、剪接、印跡、表觀遺傳控制以及基因轉錄調控[44]。lncRNAs表達的失調存在于各種人類疾病中，尤其是乳腺癌、肺癌、胃癌、結直腸癌等[45]。有證據表明，lncRNAs參與人類結直腸癌的發生和進展，并可能作為新的治療靶點[46]。越來越多的證據表明，lncRNA可以充當競爭性內源RNA，與miRNA競爭下游靶基因的結合位點，從而抑制miRNA的功能[46-47]。Liu等[48]研究發現，在結直腸癌中lncRNAs可以發揮競爭性內源RNA的作用與miR-7競爭，影響其下游的靶基因SH3GLB1的表達和PI3K/Akt信號通路，從而發揮重要的作用。

4 小 結

越來越多的證據表明，miR-7是結直腸癌的一個重要抑制因子，其表達水平降低是結直腸癌發生、發展和轉移的重要因素。因此，miR-7在結直腸癌診治中具有良好的應用前景。miR-7可作為一種潛在的結直腸癌診斷標志物[49]。Wang等[16]發現，結直腸癌患者血清中miR-7水平明顯低于健康對照組，隨后學者基于training cohort建立Logistic回歸模型，利用validation dataset進行驗證，結果表明，miR-7在區分結直腸癌患者和健康人方面具有很高的準確性(training cohort和validation dataset上的曲線下面積分別為0.866和0.897)。此外，Ahmed等[50]通過檢測結直腸癌患者和健康人糞便中miR-7的水平發現，miR-7在糞便中的表達水平也存在明顯差異，提示通過檢測糞便中miR-7的水平可輔助診斷結直腸癌。因此，有學者開始研究miR-7作為腫瘤診斷依據的可行性。

miR-7可通過多種信號轉導通路在多種腫瘤的生長、侵襲以及轉移中發揮重要作用，其過表達可通過多種途徑抑制腫瘤的生長和侵襲。因此，有學者開始研究miR-7作為腫瘤治療新靶點的可行性。Tazawa等[51]構建了高表達miR-7的溶瘤腺病毒治療腫瘤，該病毒高表達的miR-7通過影響多種轉錄因子，誘導腫瘤細胞發生自噬，從而導致結直腸腫瘤細胞發生凋亡。以上研究提示，miR-7可作為治療結直腸腫瘤的新靶點。相信隨著人們對miR-7認識的不斷加深，其有望為研究直結腸癌的發生、發展以及臨床診治提供一條新思路。