微滲漏檢測方法的研究進展

方玉葉，呂長海

(昆明醫科大學附屬口腔醫院兒童口腔科，昆明 650106)

完善的根管治療需要良好的冠方及根方封閉，可防止根管與根尖周之間組織液的微循環以及口腔內細菌的滲入與根管內殘留細菌的影響[1]。微滲漏指充填材料與牙體間或充填材料自身的微小間隙使口腔內微生物及其代謝產物、化學物質、液體、分子或離子等滲入，微滲漏的深度可至窩洞的底部，從而引起過敏反應、繼發齲、牙髓刺激和邊緣染色等[2]。牙體組織與充填材料不密合可導致微滲漏的發生，是根管治療失敗最主要的原因，且冠方微滲漏較根尖微滲漏更容易導致治療失敗[3]。此外，臨床醫師的操作充填技術、密封劑的理化性能和玷污層的去除程度等因素對微滲漏也有較大影響。

目前，微滲漏檢測大多通過體外研究觀察。常用的檢測方法有染料滲漏法、染料提取法、流體濾過法、電化學法、微生物滲透法、葡萄糖滲漏法、放射線同位素、掃描電子顯微鏡、微型計算機斷層X線掃描等[4]。但關于封閉劑封閉能力的研究尚未達成共識，現對近年來微滲漏檢測方法的研究進展予以綜述。

1 染料滲漏法

染料滲漏法由Grossman提出，指將特定染料經某種方式滲入需要檢測的目標物體中，通過對染料的觀察評價目標物體微滲漏情況，操作簡單，是目前最常用的體外檢測方法[5]。封閉根尖2 mm以上的牙體后，根尖浸泡于染料內，染料通過根管壁與充填材料或充填材料本身的空隙滲漏，這是一種在常規大氣壓力下進行的被動染料滲漏法，可采用縱向剖開、橫向剖面和透明牙法，用線性方法觀察染料的滲漏深度[6]。常用的染料有伊紅、亞甲藍、印度墨水、堿性品紅、龍膽紫、熒光染料、硝酸銀等[7]。

縱向剖開和橫向剖面是從二維角度觀察滲漏情況。縱向剖開是在立體顯微鏡下觀察滲漏深度，受試驗者的主觀影響；隨機選擇剖開面，通過染料滲透最深點的概率極低，導致低估滲漏。橫向剖面只能確定每一節是否有滲透，以上兩種方法由于技術本身(鋸片厚度)會造成牙本質組織和染料的部分丟失[6]。

透明牙法是通過10%硝酸脫礦、不同濃度乙醇溶液脫水和水楊酸甲酯浸泡的過程使牙齒變透明，以便提供根管內部解剖結構的三維圖像，其優點是沒有牙體組織損失，更清晰地觀察側副根管滲漏區域及充填材料與根尖孔的關系[8-9]。若脫礦脫水不完全會降低牙齒的透明度，牙齒長期浸泡在硝酸、乙醇等酸溶液中可引起染料溶解。

被動染料滲漏法中根管充填材料間隙內空氣會阻礙染料滲漏，故出現了真空或離心狀態下的主動染料滲透法[4]。但有研究表明，染料更容易滲漏到無水空隙，故主動染料滲漏法的滲漏明顯高于被動染料滲漏法[10]。染料滲透法是一種定性實驗，因具有較好的敏感性、易用性、便利性和成本效益而應用廣泛[11]。但由于擴散現象不能立刻得到結果,故需對樣本進行破壞性分析，不能重復實驗。

2 染料提取法

染料提取法是基于染料滲漏法的一種定量實驗，除根尖以外的牙體組織被封閉，在正常大氣壓下，浸泡在染料內48～72 h，流水沖洗30 min清除牙體表面的封閉材料，放入酸性溶液(如65%硝酸)3 d，釋放出界面所有染料，再將液體置入離心機離心(14 000 r/min，5 min)[12-13]。基于每種物質特有的吸收光譜，不同染料對光的選擇性吸收波長及相應的吸收系數是固定的物理常數，應用分光光度計進行光學密度分析，取離心后的上層均一溶液，測定出溶液中染料對光的吸收度，從而計算出染料的含量[14]。亞甲藍、甲苯胺藍、堿性品紅分子大小與細菌毒素相似，常用吸光度法測定[15]。染料提取法操作簡單，不需要昂貴的設備，但溶液中的雜質及溫度變化等均可影響測量結果。

3 流體濾過法

流體濾過法通過氣泡在微量管內的位移距離計算微滲漏，經改造用于根管微滲漏的測量，樣本冠方與大氣壓下裝滿水的管道連接，根尖與帶刻度的微量管相連，由冠方向根尖施加恒定的壓力，當樣本存在間隙時，水通過間隙使微量管中氣泡發生位移，根據記錄的位移距離及流體動力源公式計算微滲漏[16]。目測觀察位移存在一定誤差，現采用計算機控制和數字氣壓設備，基于光的折射反應通過計算機控制的激光二極管觀察氣泡運動[17]。

流體濾過法是定量實驗，不破壞樣本，不需要示蹤劑，消除了分子大小、與牙本質親和力或pH等有關因素的影響；可在不同時間反復測量，通過改變施加壓力或微量管直徑來調節系統靈敏度，但不能反映微滲漏發生的位置[18-19]。測量時間、施加壓力、含氣泡管的直徑、氣泡長度等沒有標準化，可能導致實驗結果不同[20]。長時間高壓會導致樣本新的間隙形成[21]。染料提取法與流體濾過法都考慮到材料的多孔性，實驗結果存在一定相關性，但流體濾過法測量時，液體可在空隙中達到平衡，使濾過減少[22]。

4 電化學法

金屬與腐蝕性物質接觸，可通過電極反應(一種電化學反應)發生腐蝕。Jacobsen和Fraunhofer[23]依靠離子在空間內擴散進行了電化學微滲漏實驗，將除冠部和根尖牙體外都封閉，冠部和根尖被分別浸泡在兩個獨立電解質溶液中，將電解質中的電極與穩壓器連接，用電流計測量通過充填材料的電流，根據歐姆定律得出樣本阻抗。微滲漏大小與阻抗值成反比、與電流大小成正比，電流大小與電解質與電極的接觸面積成正比[24]。

穩壓器分為直流穩壓器和交流穩壓器。應用直流電靈敏度有限，且可產生極化效應，只有電解質擴散到整個界面時才能進行記錄測量，且不能用于測量冠部密封缺損樣本；而交流電連續測量時不產生極化效應，低值電位(40 mV)對牙體內部電荷分布不產生干擾，封閉后可立刻測量電流值，此方法敏感，較常使用[25]。

電化學法是一種定量實驗，無損樣本，可長時間對同一樣本進行多次測量，并可評估熱循環、老化、機械應力等對牙齒與充填界面的影響[25]。但電解質的組成、電極類型及各電極之間距離、電極厚度等會對實驗結果產生影響；電極上腐蝕沉積物的積累阻礙離子流動擴散，影響電流值的準確表達[26-27]。測定樣本的充填修復體只適用于非金屬材料，而對于金屬材料的結果并不準確[28]。

5 微生物滲透法

人體口腔是個復雜的微生態環境，存在種類繁多的天然菌群，各部位微生物群體差異很大，細菌微生物較染料等物質更能體現臨床相關性，故Goldman等提出微生物滲漏法[29]。檢測微生物滲漏主要有雙室滲漏模型、掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)及聚合酶鏈反應3種方法。最常用的是雙室滲漏模型，實驗前對滲漏裝置進行消毒，充填物冠方是含細菌的培養液，根尖是無菌培養基，封閉除根尖2 mm外的牙體，無菌培養基變渾濁則表明發生微滲漏[30]。在SEM和聚合酶鏈反應中，可直接在根管或牙本質小管中觀察到或檢測到細菌[31]。對目標微生物檢測具有較高的特異性是聚合酶鏈反應技術的最大優點，也適用于封閉前根管內有細菌殘留的情況[32]。

常見的示蹤菌有糞腸球菌、變異鏈球菌、表皮葡萄球菌、產黑普氏菌、嗜酸乳桿菌、齒狀放線菌、熒光假單胞菌、具核梭桿菌、白色念珠菌等，可以是單一細菌或混合菌群，但結論因細菌種類不同而不同。糞腸球菌是最常用的示蹤菌，它是正常口腔的菌群組成，也是根管內最常見的微生物，常合并需氧和厭氧菌感染[33]。利用唾液進行微生物泄漏實驗，可以刺激根管內殘留細菌的生長繁殖，更好地模擬單一細菌或混合菌群滲漏的臨床環境，但不能模擬溫度和唾液流動等變化[34]。

微生物滲透法是一種定性實驗，較好地模擬了臨床和生物環境，細菌微生物的大小、生物活性都與口腔病理生理活動相關；細菌不能到達的微小空隙，其產物可以滲入，且細菌產物可早于細菌進入根管系統。只要有一種細菌通過封閉的根管就會在培養基中繁殖引起渾濁，且不能估計根尖感染時間；此外，具有抗菌性能的材料(如丁香酚糊劑)不能用微生物法測定微滲漏[5]。

6 葡萄糖滲漏法

葡萄糖具有親水性和化學穩定性，是細菌微生物所需的營養物質，分子量很小(重均分子量為180)，可使根管內殘留的細菌繁殖，有較好的臨床相關性[35]。Xu等[20]用葡萄糖作為示蹤物來分析根管微滲漏，充填物冠方是葡糖糖溶液，通過靜水壓力使葡萄糖分子滲入根管，抽取根尖區溶液，用分光光度計測量濾過根管的葡萄糖含量，通過葡糖糖氧化酶-過氧化物酶法得出葡萄糖濃度，從而算出不同時間間隔的微滲漏。分光光度計檢測值在0.02～1.2(相當于葡萄糖濃度0.6～79.6 mg/L)，低于最低值將被忽略，超過最高值將無法檢測[36]。有報道用分光光度計和葡萄糖試紙得出的葡萄糖濃度平均值相似，兩者之間存在相關性，葡萄糖試紙費用較低，是檢測葡萄糖滲漏值的有效方法[37]。

葡萄糖滲漏法是一種定量實驗，能夠連續無創測量微滲漏，具有成本低，特異度和靈敏度高的特點，且不受觀察者主觀因素影響[38]。但操作中存在較難維持無菌狀態、葡萄糖水分消耗和蒸發、葡萄糖可能滲漏到牙本質而非根尖等問題。有研究表明，葡萄糖在堿性環境下可轉化為不能被檢測的葡萄糖酸鹽，根管充填材料sealer 26及礦化物三氧化物凝聚體含有氫氧化鈣，根管消毒時殘留的氫氧化鈣會影響實驗結果，不適合用葡萄糖滲漏法，故有學者提出用蔗糖代替葡萄糖作為示蹤物[39-40]。

7 放射性同位素

放射性同位素是將含同位素的溶液放置在充填材料冠方，可定量測量根尖滲出同位素的放射活性，常用的示蹤劑有14C、45Ca、131I、32S、22N、99Tc等。γ計數器具有較高的靈敏度和特異度，可以精確地計算出放射性物質的劑量，直觀反映出微滲漏的大小，測量時不受操作者的主觀影響。放射性同位素顆粒約為40 nm，最小的色素顆粒為120 nm，細菌的大小為50～1 000 nm，具有高度的穿透性，可以提供更精確的微泄漏量信息[41]。但有研究表明，同位素45Ca與牙齒和部分修復材料有親和力，且能滲入其中，并導致測量誤差[26]。放射性同位素具有較好的重現性和較高的準確性，但相同材料的形狀和表面紋理不同可影響放射性同位素的黏附程度，導致測量結果不同；測量時需要精密的材料和儀器，具有放射性損害，目前較少使用[18]。

8 SEM

SEM是檢測和分析實體對象最常用的工具，通過聚焦電子束向樣本發射電子，依據電子與樣本中原子的相互作用，檢測樣本中發射的次級電子，探測體收集次級電子后，轉化為不同強度的電信號，可獲取被測樣本的各種理化性質信息，形成完整的圖像[42]。

SEM是一種定性方法，常與染料滲漏法結合用于觀察滲漏的程度。采集速度快、放大倍數大，圖像分辨率高，樣本損傷和污染程度小，可從多個角度同時對樣品表面進行三維成像。但需要特殊的設備和真空條件，檢測前樣本需脫水和干燥，否則可能導致充填材料間產生裂隙，影響微滲漏。

9 微型CT

微型CT是一種三維成像方法，其分辨率與光學顯微鏡相當，已應用于口腔領域。隨著微型CT技術的發展，現可用于檢測裂縫及微滲漏[43]。臨床上，微型CT的分辨率(體素<0.001 mm)較CT及磁共振高(體素0.7 mm)，可更好地描述較小結構，并對三維數據集進行處理，以建立精確的解剖模型[44]。

掃描儀X射線垂直樣本，用光敏探測器記錄未吸收的光子信號，利用圖像分析軟件將輻射不透明度轉換為灰度值，最終成像取決于材料原子序數和質量密度，高于閾值的灰度值自動轉換為“白色”，而低于閾值的灰度值被轉換為“黑色”。如果組織間密度相似，將很難視覺識別，則需要浸泡或注射造影劑[45-46]。

微型CT結合三維重建技術可定量微滲漏，并立體重現微滲漏形態；定位準確，可在干預前后進行評估，測量充填材料中的間隙體積，同時保持樣本完整性。但微型CT的測量精度(1.8 μm)較電子顯微鏡(0.25 μm)低，需要特殊儀器輔助操作，測量的時間和成本較高[47]。

10 小 結

隨著科學技術的發展，各種新技術和新設備的出現對口腔和臨床醫學的發展起重要作用。在口腔臨床實踐中，緊密密封根管非常重要，目前關于微滲漏的檢測方法較多，由于尚無不同檢測方法的統一標準，且受觀察者主觀因素的影響，故使用同一種檢測方法結果也存在一定的差異，從而干擾研究的最終結果。微滲漏檢測方法基本均在體外進行，以人類離體牙為樣本，模擬臨床封閉操作，故實驗結果與臨床有一定的相似，但人類口腔內環境多變，充填材料受食物溫度變化、咀嚼力等因素影響，其中熱因素對微滲漏的影響最大，故不能完全模擬口腔內微生態的環境變化。因此，進一步研究微滲漏實驗的臨床相關性及不同微滲漏檢測方法之間的可靠性和相關性，更好地將不同方法結合，從而得到較為準確的結果，對提高臨床治療效果具有重要意義。