非編碼RNA與肝纖維化的研究進展

樊政華,張偉輝

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院微創膽道外科，哈爾濱 150001)

肝纖維化是指各種內源性和外源性損傷因子如炎癥、細菌、病毒感染、酒精及藥物毒性或遺傳因素等作用于肝臟細胞導致的肝內結締組織異常增生、細胞外基質沉積、肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)活化的病理過程，是多種慢性肝病，包括病毒性肝炎、酒精性脂肪肝以及膽汁淤積性肝病向肝硬化轉變的必經階段。HSC的激活在肝纖維化過程中起主導作用[1]。在正常情況下，HSC通常保持靜止狀態，其增殖活性及合成膠原的能力較低。但在損傷因子的作用下，HSC可激活并轉化為肌成纖維樣細胞。肌成纖維樣細胞可以分泌促成纖維介質，如轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、結締組織生長因子、金屬蛋白酶組織抑制物等，并生成膠原、纖維連接蛋白以及層粘連蛋白等細胞外基質，從而在肝纖維化的發生中發揮關鍵作用。

非編碼RNA(non-coding RNAs，ncRNA)是指基因轉錄過程中不編碼蛋白質的RNA分子,包括微RNA(microRNA,miRNA)、長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)、小核RNA(small nuclearRNA，snRNA)、核仁小分子RNA(small nucleolar RNA,snoRNA)、小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)等。ncRNA與穩定存在、編碼蛋白質的信使RNA(messenger RNA,mRNA)不同，ncRNA數目龐大、功能多樣，廣泛參與轉錄和轉錄后調控、染色質修飾、蛋白質功能調控等過程。許多ncRNA參與調控肝纖維化的發展，其在肝纖維化中的作用機制已成為當前研究的熱點。現就ncRNA在肝纖維化過程中的作用予以綜述。

1 肝纖維化過程中miRNA的作用機制

miRNA是一類長約22個核苷酸的內源性單鏈非編碼RNA分子，其在肝纖維化中通過調控TGF-β/Smads蛋白、Hedgehog(Hh)、Wnt蛋白、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、含半胱氨酸的胱天蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)等信號通路，對HSC的活化、增殖、凋亡、細胞外基質沉積以及上皮-間質轉化等多個方面起調節作用[2]。

1.1 miRNA通過TGF-β信號轉導途徑調控肝纖維化 TGF-β是一組可調節細胞生長分化的多功能蛋白，可激活其下游信號分子Smads蛋白與膜受體結合并進入細胞核內，通過調節靶基因的轉錄，影響肝纖維化過程。Murakami等[3]的研究表明，miR-199和miR-200家族都與肝纖維化有關，miR-199 a*和miR-200 b可通過其候選靶點TGF-β誘導因子與Smads特異性e3泛素蛋白連接酶2結合，從而影響HSC的增殖、活化以及上皮-間質轉化過程，調節肝纖維化的發展。Sun等[4]的研究顯示，miR-200a的表達水平在TGF-β1誘導的HSC激活和四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化中降低，而miR-200a的過表達可顯著降低TGF-β1誘導的α-平滑肌激動蛋白(α smooth muscle actin，α-SMA)的表達水平，轉染miR-200a后可與其下游β-聯蛋白和TGF-β2靶向結合，并抑制mRNA和蛋白質的表達，阻礙HSC增殖活化。Ji等[5]研究發現，miR-27a可作用于其下游分子靶點Smad5及TGF-β通路中腺嘌呤核苷三磷酸-檸檬酸合酶的mRNA，促進HSC活化，降低細胞質脂滴，加劇肝纖維化的發展。miR-155在多個水平影響肝纖維化，可通過血小板衍生因子、Smad2/3以及CCAAT增強子結合蛋白β的直接和間接靶點發揮作用[6]。miR-16的表達水平在丙型肝炎病毒感染誘導的肝纖維化組織細胞中上調，并通過靶向肝細胞生長因子和Smad7負向調節肝纖維化的進展[7]。在四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化中，miR-30c和miR-193的表達下調，通過調節鋅指蛋白轉錄因子和TGF-β2參與肝纖維化的發展[8]。miR-17-5p通過抑制Smad7的表達調節TGF-β/Smad信號轉導途徑，進而影響Ⅰ型膠原和α-SMA的合成，促進HSC的增殖和活化[9]。Zhao等[10]的研究表明，miR-101對TGF-β1誘導的肝細胞上皮-間質轉化過程有明顯的抑制作用，可通過結合TGF-βⅠ型受體和鋅指轉錄因子9的mRNA，減少TGF-βⅠ型受體、TGF-β1、血小板衍生生長因子、結締組織生長因子以及纖維化相關的炎癥因子如基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-1及Ⅰ型膠原的產生。另外，miR-101還能靶向結合ZEB1(zinc finger E-box binding homeobox 1) mRNA的3′-非翻譯區，抑制ZEB1的表達，影響肝纖維化發展。Ogawa等[11]的研究顯示，TGF-β可通過Smad3與miR-29基因啟動子結合，誘導miR-29下調，而Smad7基因敲除后能增強TGF-β對miR-29的抑制作用。

在肝纖維化中，miR-29b具有抑制TGF-β1的作用，miR-29 b可通過直接與HSC中Ⅰ型膠原蛋白基因3′-非翻譯區和特異性蛋白1基因3′-非翻譯區結合，共同抑制Ⅰ型膠原的表達，從而激活HSC[12]。miR-30通過抑制TGF-β信號通路靶基因Kruppel樣轉錄因子11促進Smad7的表達，使HSC增殖和遷移的能力減弱，逐漸由激活狀態轉化為失活狀態，由此抑制肝纖維化的發展[13]。Lakner等[14]將活化的HSC中miR-19b的表達水平提高后，TGF-β信號轉導途徑中TGF-βⅡ型受體和Smad3的表達明顯下降，miR-19b可與TGF-βⅡ型受體的3′-非翻譯區直接結合，減少Ⅰ型膠原及α1和α2前膠原mRNA的表達，抑制纖維化過程中HSC的激活。He等[15]發現，miR-146a的表達在肝纖維化過程中以劑量依賴性方式下調，在TGF-β1刺激的HSC中，miR-146a可顯著降低Smad4蛋白的表達，表明miR-146a可通過靶向Smad4在TGF-β1誘導期間作為新型調節劑調節HSC的活化。Wang等[16]研究了miR-181a/b對HSC T6增殖的影響發現，TGF-β1處理的HSC T6中miR-181a/b(特別是miR-181b)顯著上調,miR-181b可通過調節細胞周期調節因子p27促進HSC增殖。Iizuka等[17]研究顯示，在肝纖維化大鼠肝組織中miR-214-5p的表達顯著上調，其過表達可激活TGF-β信號轉導途徑，其機制與Twist-1基因表達上調有關。

1.2 miRNA通過Hh信號轉導途徑調控肝纖維化 Hh信號轉導途徑由Hh配體SHH、IHH，膜蛋白受體1、膜蛋白受體2、Smoothened(SMO)以及3種鋅指轉錄因子(Gli1、Gli2和Gli3)等組成，在肝纖維化中與HSC的增殖活化密切相關。Yu等[18]研究表明，miR-152參與其靶基因DNA甲基轉移酶(DNA-methyltransferase，DNMT)1 mRNA的降解和轉錄后調控，促進了Hh信號途徑的負調節因子膜蛋白受體1啟動子的去甲基化，從而抑制肝纖維化中上皮-間質轉化過程。Kumar等[19]研究顯示,在膽總管結扎術誘導的小鼠肝纖維化中，miR-29b1可通過調控Ⅳ型膠原蛋白、C-myc癌基因、血小板衍生生長因子β、PI3K/Akt等多種促纖維化基因，抑制Hh信號轉導途徑的活化及肝細胞外基質沉積，影響肝纖維化的發展。大鼠的HSC活化后，miR-200a的表達下調，其可通過調節鋅指轉錄因子Gli2、上皮-間質轉化、Wnt/β-聯蛋白以及TGF-β等信號轉導途徑，抑制Hh信號轉導，減少相關基因的表達，影響肝纖維化過程[20]。Hyun等[21]的研究發現，在活化的HSC中，miR-378a-3p的表達水平與Hh信號轉導途徑中鋅指轉錄因子Gli3的表達呈負相關,miR-378a-3p可通過靶向調節Gli3的活性，影響HSC的增殖活化。

1.3 miRNA通過Wnt信號轉導途徑調控肝纖維化 Wnt是一類分泌型糖蛋白，由HSC以自分泌的方式釋放到細胞外，Wnt通過結合HSC膜上的卷曲蛋白/低密度脂蛋白受體相關蛋白調節HSC的活化[22]。Wnt/β-聯蛋白信號通路主要由Wnt蛋白、Dishevelled(Dsh或Dvl)蛋白、特異受體卷曲蛋白、糖原合成酶激酶-3β、β-聯蛋白及T細胞因子(T cell factor，TCF)/LEF(lymphoid enhancer factor)轉錄因子家族等構成。miR-146a-5p抑制HSC活化和增殖的機制是負向調控Wnt1和Wnt5a的表達，通過降低α-SMA、Ⅰ型膠原、MMP-2的表達，增加Smad7的表達，抑制肝纖維化的發生[23]。在肝纖維化中miR-145通過抑制靶基因轉錄因子ZEB2的表達，抑制Wnt/β-聯蛋白通路中β-聯蛋白及其下游基因細胞周期蛋白D1和C-myc癌基因影響HSC的增殖活化[24]。在激活的HSC中miR-378a-3p的表達下調，其通過抑制靶基因Wnt10a，促進Wnt/β-聯蛋白通路中β-聯蛋白的磷酸化和糖原合成酶激酶-3的表達，影響肝纖維化的發生[25]。

1.4 miRNA通過PI3K/Akt信號轉導途徑調控肝纖維化 PI3K/Akt信號轉導途徑廣泛存在于各種細胞,通過調節下游相關蛋白的表達介導細胞的增殖、活化、遷移、存活以及凋亡。人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten gene,PTEN)是PI3K/Akt信號通路的負向調節因子,在肝纖維化中其編碼的產物可使肌醇三磷酸去磷酸化為肌醇二磷酸，從而抑制Akt的活化，進而抑制HSC增殖，誘導HSC凋亡[26]。Bian等[27]研究表明，PTEN表達的缺失可因基因突變(如缺失或插入)或表觀遺傳學改變(包括啟動子高度甲基化)所致，采用DNA甲基化抑制劑5-aza-2′-脫氧胞苷可阻斷DNA的甲基化，抑制HSC-T6細胞增殖，下調Ⅰ型膠原和α-SMA基因的表達，且DNMT1的上調可導致PTEN基因啟動子甲基化，導致PTEN基因表達下調，HSC活性增強。

Garzon等[28]的研究顯示，miR-29b不僅可通過直接靶向DNMT3a和DNMT3b而促進DNA低甲基化,還可通過下調DNMT1基因的轉激活因子Sp1，間接降低DNMT1的表達，從而促進DNA低甲基化。在肝纖維化過程中，miR-29b在體內和體外的表達均有所下降，其可通過直接作用于靶基因DNMT3b導致PTEN的甲基化狀態缺失，由此抑制Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Ⅲ型膠原及α-SMA的表達，降低HSC的活化[29]。在四氯化碳處理的小鼠中，miR-29b的引入使α-SMA、Ⅰ型膠原以及金屬蛋白酶組織抑制物-1的表達明顯下調，miR-29b顯著降低HSC細胞和纖維化動物模型中PI3K調節亞基1、Akt3和p-Akt3蛋白的表達，導致PI3K/Akt信號通路失活，誘導HSC凋亡[30]。

Wei等[31]的研究表明，miR-21可使PTEN的表達降低，而PTEN的失活會增加p-Akt及α-SMA、Ⅰ型膠原和MMP-2的表達,使HSC轉化為肌成纖維細胞、細胞外基質重塑及間質纖維化，從而影響肝纖維化的發生。在肝纖維化過程中，miR-181b可通過調節PTEN參與PTEN/Akt信號通路以激活HSC，也可通過抑制p27蛋白促進HSC的增殖活化[32]。在HSC活化過程中，miR-200b可通過調節靶基因FOG2(friend of GATA 2)促進HSC增殖和遷移，從而增強PI3K/Akt信號通路中Akt的磷酸化，影響肝纖維化的發生[33]。miR-222可作用于絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A 55 kDa調節亞基Bα mRNA的3′非翻譯區，導致絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A 55 kDa調節亞基Bα表達的降低，從而激活Akt信號轉導途徑，抑制HSC細胞凋亡[34]。miR-222的表達在膽管閉鎖肝纖維化患者的肝臟中顯著升高，而miR-222抑制劑可抑制人HSC LX-2細胞的增殖，這間接支持了miR-222參與激活Akt信號轉導途徑[35]。Li等[36]研究顯示，miR-33a的表達與Ⅰ型膠原增殖及α-SMA的表達密切相關，轉染miR-33a抑制劑后，其潛在靶點過氧化物酶體增殖物激活受體α mRNA和蛋白的表達顯著增加,影響PI3K/Akt信號通路的激活，減少HSC相關細胞外基質的合成,抑制肝纖維化的發生。

1.5 miRNA通過NF-κB信號轉導途徑調控肝纖維化 NF-κB是一類核蛋白因子,參與免疫反應、炎癥反應、細胞增殖以及分化等生物過程。NF-κB家族主要由p50、p52、RelA(P65)、RelB和cRel組成，其形成同源二聚體或異二聚體，其中p50-RelA(又稱p50-p65)是NF-κB中含量最多的一種。在靜止狀態的細胞中，大部分的NF-κB二聚體通過與NF-κB抑制蛋白(inhibitor-κ binding protein，IκB)α、IκBβ、IκBε中的某一個結合，而處于無活性狀態，可通過降解IκBs的方式活化NF-κB，IκBs可被IκBs激酶磷酸化，活化的NF-κB轉移到細胞核內與DNA結合，并作為轉錄因子發揮作用。NF-κB是炎癥反應的重要介質，可通過激活細胞因子級聯反應以及產生其他促炎介質促進HSC激活，促進肝細胞上皮-間質轉化,從而導致肝纖維化。一些miRNA可調節NF-κB的表達。

Feng等[37]研究了miR-126在HSC活化過程中的作用,上調miR-126的表達在轉錄后水平明顯抑制了其下游靶點IκBa的表達，導致NF-κB激活，并促進其下游信號因子如TGF-β1、Ⅰ型膠原等的表達；而抑制miR-126后可使IκBa蛋白上調，抑制NF-κB活化，導致肝纖維化的發生。Hyun等[21]發現，在肝纖維化中miR-378a-3p的表達下調，使用SMO基因激活NF-κB后可抑制miR-378a-3p的轉錄表達，miR-378a-3p的減少則可引起鋅指蛋白Gli3和Gli2表達的增加，從而促進Hh信號蛋白的表達，加速肝纖維化的形成。

1.6 miRNA通過胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信號轉導途徑調控肝纖維化 ERK包括ERK1和ERK2，是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與調節各種生物效應如細胞增殖、分化、凋亡。Dai等[38]發現，ERK1信號通路通過促進有絲分裂和纖維化促進HSC活化，并在肝實質上皮細胞的上皮-間質轉化過程中加速成纖維細胞的轉變；抑制ERK1信號通路可能起到抑制肝纖維化發展的作用。Ye等[39]的研究表明，miR-155可直接與TCF4 mRNA的3′-非翻譯區和血管緊張素Ⅱ受體1結合，TCF4是促進上皮-間質轉化的轉錄因子，血管緊張素Ⅱ受體1可增強ERK1信號通路活性，TCF4和血管緊張素Ⅱ受體1可能是miR-155的靶基因，通過調節上皮-間質轉化過程和ERK1信號轉導途徑促進肝纖維化。Zhao等[40]研究顯示，在肝硬化患者和大鼠血清和肝組織中miR-21的含量顯著升高，miR-21可通過靶向抑制側支發芽因子同源物2的表達刺激HSC活化，以增強ERK1信號，同時還可通過下調肝細胞核因子4α的表達，觸發肝細胞的上皮-間質轉化過程，從而促進成纖維細胞的積累，影響肝纖維化進展。

1.7 miRNA通過caspase信號途徑調控肝纖維化 caspase是一類富含半胱氨酸的蛋白酶家族，通常在細胞中以無活性的酶原形式存在，其內部特異的天冬氨酸殘基部位經裂解加工后可引起酶原激活，并誘導HSC凋亡。Guo等[41]研究顯示，在大鼠靜止期和活化期HSC中miR-15b和miR-16的表達水平與B細胞淋巴瘤-2基因水平呈負相關，其可能通過靶向B細胞淋巴瘤-2和caspase信號轉導途徑而對HSC的凋亡起關鍵作用。

2 在肝纖維化過程中lncRNA的作用機制

lncRNA廣泛存在于真核細胞內，是一種由聚合酶Ⅱ轉錄的長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，本身并不編碼蛋白質，但其在肝臟纖維化過程中發揮著重要作用。研究發現，lncRNA-MALAT1不僅作為內源競爭性RNA通過堿基互補配對與miR-101或PrimiR-101b結合，而且還能促進靶基因Rac1的表達[42]。lncRNA-MALAT1還可與組蛋白去乙酰化酶沉默信息調節因子結合以抑制其降解，從而促進HSC的活化[42]。研究表明，漿細胞瘤變異易位1通過競爭性結合miR-152抑制膜蛋白受體1的表達，從而激活Hh和上皮-間質轉化信號通路，從而促進HSC的活化，影響肝纖維化的形成[43]。Zhang等[44]研究發現，lncRNA生長停滯特異性轉錄本5通過RNA誘導的沉默復合體負向調節miR-21，而miR-21可通過調節PTEN以及Akt通路，上調MMP-2的表達，進而參與肝纖維化。lncRNA 生長停滯特異性轉錄本5還可競爭性結合miR-222，使其靶基因周期素依賴激酶抑制劑p27的表達上調，從而抑制HSC活化及肝纖維化的發生[45]。

Zhou等[46]研究發現，甲基化CpG結合蛋白2過表達會降低HSC中lncRNA H19的水平，敲除甲基化CpG結合蛋白2可降低其表達。同時，敲除lncRNA H19可增加胰島素樣生長因子1受體蛋白的表達水平，過表達則可減少。因此，lncRNA H19對肝纖維化的發展具有雙重調節作用。Bian等[47]研究表明，miR-148b模擬物的轉染降低了HOX轉錄反義RNA的熒光素酶活性，明顯抑制了lncRNA HOX轉錄反義RNA介導的HSC活化。敲除miR-148b后，lncRNA HOX轉錄反義RNA的表達增加，表明 HOX轉錄反義RNA和miR-148b是相互作用的靶點，并且雙向調控著HSC的活化。lncRNA人母系表達基因3能夠激活p53，并且活化的p53轉移至線粒體外膜與Bcl-2家族成員相互作用，使細胞色素C的釋放增加，激活caspase及p53/caspase-3信號轉導途徑以誘導HSC失活，從而抑制肝纖維化的發展[48]。有研究發現，被TGF-β活化的lncRNA在肝纖維化患者肝組織和血漿中的表達顯著增加，被TGF-β活化的lncRNA可與TGF-β受體Ⅱ、Smad2競爭性結合miR-425-5p以促進膠原形成及HSC活化，從而影響肝纖維化的發生[49]。lncRNA-Alu調控的p21轉錄調節因子(Alu-mediated p21 transcriptional reyulator,APTR)的表達在活化的HSC和肝硬化患者的血清中明顯增加，沉默APTR能夠解除HSC內TGF-β1誘導的α-SMA表達的上調；敲除APTR能夠抑制體內HSC的激活和膠原的累積，同時其細胞周期和細胞增殖也被抑制，而這種作用可通過沉默p21緩解，說明APTR可通過抑制p21的轉錄促進HSC的激活和增殖，影響肝纖維化的發生[50]。

3 問題與展望

除miRNA、lncRNA外，其他ncRNA如snRNA、snoRNA、siRNA等也在肝纖維化中發揮著重要作用，但由于數目眾多，并且ncRNA可作用于不同的靶基因調節肝纖維化，而相同的靶基因又受到不同ncRNA的影響,其關系錯綜復雜，目前研究尚處于初期階段。因此，篩選在肝纖維化過程中發揮重要作用的ncRNA，了解其調控機制，根據基因靶點、環節,研發更為安全、高效、有針對性的藥物,將對肝纖維化及肝硬化的預防和治療產生深遠影響，為闡述慢性肝病的病理生理過程提供新思路，也為慢性肝病的治療提供新方向。