IGFBP-6與類風濕關節炎關系的研究進展

孫 莉,王曉非

(中國醫科大學附屬盛京醫院風濕免疫科,沈陽 110022)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種常見的慢性風濕性疾病，全球患病率約為1%,女性明顯多于男性[1]。RA的典型臨床表現為多關節腫脹、疼痛，可累及心臟、皮膚、肺臟、胃、腎臟等多個器官[2]。RA的發病機制復雜，免疫細胞自外周血遷移至關節局部是滑膜炎發生的關鍵。滑膜增生、血管翳形成以及免疫細胞過度遷移、凋亡減少等共同作用導致關節局部炎癥長期持續存在，引起關節破壞，影響患者的工作和生活。RA目前尚無根治方法，臨床治療主要是緩解病情。隨著分子生物學技術的不斷發展，RA的發病機制在基因、蛋白以及細胞水平逐漸完善，治療手段也更加豐富多樣，但仍有部分患者經過充分的藥物治療仍不能達到臨床緩解[3]，提示有不明因素參與RA的發病過程。胰島素樣生長因子結合蛋白-6(insulin-like growth factor binding protein-6,IGFBP-6)是胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,IGF)活性的調節因子，IGF與RA的關系已得到證實[4]。研究發現，IGFBP-6也可通過IGF非依賴途徑誘導膠質瘤、結腸癌等腫瘤細胞遷移[5-6]。該功能的發現使IGFBP-6與RA的關系備受關注。現對IGFBP-6的生理功能及其在RA發病機制中的作用進行綜述。

1 IGF家族概況

IGF家族主要由2種IGF、3種IGF受體、6種IGFBPs、IGFBP相關蛋白以及IGFBPs蛋白酶組成。IGF包括IGF-1和IGF-2，其是細胞增殖發育必需的調控因子。IGF之所以被命名為“胰島素樣”是因為其在結構上與胰島素前體有50%的同源性，且能調節糖代謝。IGF-1在抗凋亡、調節生長發育方面起重要作用[7]。IGF-1是生長激素調節合成代謝的主要介質。IGF-2，又稱為生長調節素A，具有復雜的生理功能，是已知最復雜的生長調控因子[8]。IGF-2能夠促進細胞的有絲分裂，其與IGF-1受體結合后激活酪氨酸激酶，進而激活胰島素受體底物1，引發序列反應[9]。IGF-2是多種腫瘤的自分泌生長因子，與腫瘤預后相關[8]。

IGF-受體是細胞表面的跨膜糖蛋白，包括IGF-1受體、IGF-2受體以及胰島素受體。IGF-1受體、IGF-2受體具有不同的結構與功能。IGF-1受體是四聚體，由2個相同的α亞基和2個相同的β亞基構成，IGF-1和IGF-2主要與IGF-1受體結合發揮生理作用[10]。IGF-2受體為單體，與IGF-2結合促進IGF-2水解[11]。

IGF的生理活性主要由IGFBPs調節。IGFBPs在結構上具有高度同源性，但功能及作用機制各不相同[12]。IGFBPs作為IGF的載體，血清中約98%的IGF與IGFBP結合形成二聚體或三聚體以保護IGF免受降解，并被運送到特定組織發揮作用。處于游離狀態的IGF才能發揮生理作用。IGFBPs通過競爭性抑制IGF與IGF-受體的結合，調節IGF的活性[10]。IGFBPs均能抑制IGF的活性，但在某些特定環境可增強IGF的活性[13]。IGFBPs亦能阻止IGFs與胰島素受體的結合，從而避免嚴重低血糖。

1.1 IGFBP-6的結構及表達 IGFBP-6是IGFBPs的一員，在結構和功能上與其他IGFBPs具有共性，但同時也具有特性。IGFBP-6屬于分泌型糖蛋白，主要由肝臟星形膠質細胞合成與分泌，廣泛存在于人體組織的細胞和體液中,在肺、肝、腸以及中樞神經系統均有表達[13]。IGFBPs有3個共同的結構域：N端、C端以及中間區。N端和C端在結構上高度保守，而中間區結構易變。C端和N端在二硫鍵的作用下形成穩定的球形結構，共同組成IGF的結合位點。IGFBP1-5的N端有4個保守的二硫鍵，而IGFBP-6僅有3個，且三維結構與前者不同。IGFBP-6的C端還含有與IGFBP-3和IGFBP-5相似的肝素結合序列。IGFBP-6存在多種轉錄后修飾，包括糖基化、硫化、磷酸化，糖基化可能與IGFBP-6對IGF-2有相對較高的親和力有關[13]。IGFs、轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)-L、糖皮質激素、雌二醇、視黃酸、維生素D、p53等均能以細胞特異性方式調節IGFBP-6的表達和分泌，其中視黃酸是調節IGFBP-6表達最強的刺激因子[14]。

1.2 IGFBP-6的生理功能 IGFBP-6通過IGF依賴和IGF非依賴兩種途徑發揮功能。IGFBP-6與IGF-2結合的親和力是IGF-1的70～100倍，對IGF-1幾乎無影響[10]。IGFBP-6的經典作用途徑即IGF依賴途徑，其是通過與細胞表面受體競爭性結合IGF-2，從而抑制IGF-2介導的促細胞增殖、分化以及生長作用[15]。近年來研究較多的是IGFBP-6獨立于IGF-2的作用,其是指IGFBP-6既不與IGF-受體結合，也不調節IGF-受體，而是獨立產生作用，包括抑制血管新生、促進細胞遷移[16]。Aboalola和Han[17]研究發現，IGFBP-6可通過IGF非依賴途徑促進肌肉分化。IGFBP-6通過IGF非依賴途徑發揮作用的機制尚不完全明確，結合細胞表面及胞質內的非IGF配體、激活細胞內的信號通路、調節胞質-胞核的移位以及核內作用等可能是其作用機制[13]。IGFBP-6含有一個核定位序列，位于C端，與輸入蛋白-α結合介導IGFBP-6進入細胞核內,通過調控基因轉錄，調節細胞的分化與生長，該過程不受IGF-2的影響[13]。Ku80是修復和穩定DNA的蛋白質，IGFBP-6可通過與Ku80結合后擾亂DNA修復過程而抑制細胞生長[18]。IGFBP-6的IGF依賴與IGF非依賴途徑并非完全獨立，IGFBP-6可同時通過IGF依賴性和非依賴性途徑抑制成纖維細胞增殖。同樣，在不同細胞系中IGFBP-6可通過不同途徑誘導細胞凋亡[15]。

2 RA的發病機制

RA是一種常見的慢性炎癥性彌漫性結締組織病，病因復雜，遺傳和環境因素協同作用導致疾病的發生，其病理改變是多種免疫細胞與炎癥因子共同作用的結果。RA的三大主要特征是持續性滑膜炎、全身性炎癥以及自身抗體的產生。經過多年研究已經發現了與RA發生、發展相關的信號通路，但具體發病機制及關節作為主要受累部位的原因仍不十分明確。RA的治療藥物主要包括抗風濕藥、激素以及生物制劑。目前針對發病機制已經開發出多種生物制劑，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α抑制劑、白細胞介素(interleukin,IL)-6抑制劑、IL-1受體拮抗劑、B細胞清除劑、T細胞抑制劑等，并已應用于臨床，大部分患者取得了良好的治療效果，但依然有部分頑固性RA患者不能獲得臨床緩解，提示仍有未阻斷的信號通路，RA的發病機制仍需深入探索。

RA受累關節的病理改變過程復雜。首先是關節內滑膜細胞過度增殖，凋亡減少，增殖與凋亡比例失衡，大量增生的滑膜細胞誘導低氧環境，血管代償性新生，并產生大量趨化因子，炎癥細胞包括淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞等在趨化因子的作用下自外周血遷移至受累關節，引起關節炎癥[16]。新生血管攜帶氧氣、葡萄糖等養料，為炎癥細胞提供良好的生存環境，進而形成惡性循環。血管翳主要由異常增生的滑膜細胞、新生血管以及炎癥細胞組成，具有“類腫瘤樣”性質，能夠侵襲軟骨及軟骨下骨組織，導致關節不可逆性破壞、畸形以及功能喪失。滑膜增生是滑膜炎形成的始動事件，而外周血炎癥細胞遷移至受累關節是滑膜炎形成的關鍵事件。滑膜細胞過度增殖、代償性血管新生、炎癥細胞遷移等過程均由多種炎癥細胞因子及趨化因子等通過錯綜復雜的信號通路綜合調控。

3 IGFBP-6與RA的關系

IGFBP-6是IGF活性的調節因子。IGF-1具有促進骨和軟骨組織生長和分化，促進軟骨基質合成，維持軟骨自我更新以及抗炎作用，可通過抑制血管氧化應激、細胞凋亡以及炎癥反應調節免疫和炎癥過程[19]。段京明等[4]研究表明，IGF-1的水平與RA疼痛及腫脹關節數呈負相關，提示IGF-1與RA的病情活動度相關；RA伴骨質疏松者IGF-1的水平顯著低于不伴有骨質疏松者，提示IGF-1參與RA的骨破壞過程。以上研究均說明IGFBP-6可能與RA相關。IGFBP-6對腫瘤有雙重影響：一方面，IGFBP-6通過抑制IGF-2的活性及IGF非依賴途徑抑制血管新生，發揮抑癌作用；另一方面，IGFBP-6也促進腫瘤細胞遷移，顯示了致癌作用。

3.1 IGFBP-6與炎癥細胞活化 中性粒細胞胞外網狀陷阱(neutrophil extracellular traps,NETs)是近年來發現的一種新的中性粒細胞殺菌機制，RA關節滑膜液內的中性粒細胞激活后產生大量的NETs，同時中性粒細胞活化過程中大量組氨酸瓜氨酸化，而瓜氨酸化的蛋白是刺激RA產生抗瓜氨酸蛋白抗體的重要抗原[20]，抗瓜氨酸蛋白抗體特異性結合破骨細胞和破骨細胞前體，促進破骨細胞分化，刺激破骨細胞釋放IL-8，進而引起骨侵蝕和疼痛[21]。RA患者外周血和滑膜液中NETs的生成過程增強，并與抗瓜氨酸蛋白抗體水平及關節炎癥具有相關性[22]。NETs亦可誘導滑膜成纖維細胞表達大量促炎細胞因子。以上均說明中性粒細胞在RA發病機制有重要作用。

Conese等[23]研究發現，IGFBP-6影響炎癥狀態下中性粒細胞的功能，包括活性氧類的產生、顆粒釋放以及趨化效應。IGFBP-6是中性粒細胞活性的激動劑，與空白對照組相比，應用IGFBP-6處理后，中性粒細胞活性氧類的生成明顯增加[23]。應用N-甲酰基-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine,fMLP)或佛波醇酯孵育并經IGFBP-6預處理的中性粒細胞，與僅用fMLP或佛波醇酯處理的中性粒細胞相比，中性粒細胞活性氧類的產生無差異；對于脫顆粒，fMLP可明顯促進中性粒細胞釋放髓過氧化物酶和基質金屬蛋白酶-9，IGFBP-6雖然明顯提高了髓過氧化物酶的水平，但并不影響fMLP對中性粒細胞的刺激效應，提示IGFBP-6可能通過fMLP和佛波醇酯的信號轉導通路(包括由磷脂酶C、磷脂酰肌醇-3-激酶以及Src家族激酶構成的fMLP通路和蛋白激酶C構成的佛波醇酯通路)發揮效應的[23]。綜上，IGFBP-6雖不能引發中性粒細胞的炎性效應，但可能在炎癥反應后期起到放大炎癥的作用。

3.2 IGFBP-6與血管翳形成 缺氧是血管生成的主要調節因素。缺氧誘導因子1α和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是已知的促進血管新生的重要細胞因子[24]。缺氧誘導因子1α的激活與缺氧誘導的IGFBP-6基因的表達相關，在內皮細胞中，缺氧誘導因子1α誘導的缺氧環境上調了IGFBP-6的表達[25]。但對橫紋肌肉瘤和斑馬魚胚胎的研究發現，IGFBP-6的過表達抑制了血管生成，且此作用獨立于IGF-2,提示IGFBP-6可能參與缺氧誘導的血管生成的負反饋調節[25]。血管新生是RA關節炎癥早期的關鍵事件，是促進炎癥細胞浸潤、維持血管翳以及導致慢性炎癥持續存在的重要因素，并貫穿關節炎病理過程的始終[26]。在滑膜血管新生過程中VEGF具有關鍵作用[27]。作為促血管形成的最重要的細胞因子，RA關節中過表達VEGF可直接促進血管內皮細胞增殖，與RA血管翳的形成直接相關，也是RA直接的促炎因子，其可上調基質金屬蛋白酶的水平，引起一系列炎癥反應[27]。Zhang等[25]的研究表明，在體外培養的血管內皮細胞的培養基中單獨加入IGFBP-6后抑制了血管生成，而單獨加入VEGF時則明顯促進血管形成，IGFBP-6與VEGF共同作用抑制VEGF刺激血管生成的作用。據此推測，IGFBP-6可能通過抑制VEGF的功能參與調節RA血管翳形成，但IGFBP-6與RA血管翳生成的關系尚未得到直接證實。

3.3 IGFBP-6與骨代謝 RA的骨破壞在疾病早期即可出現，軟骨及骨的破壞是關節內骨質分解代謝超過合成代謝的結果。骨形成和骨丟失平衡的維持主要取決于成骨細胞的功能狀態。破骨細胞的主要作用是骨吸收，是RA骨破壞的關鍵細胞成分[28]。IGF作為生長因子，同樣能調節軟骨及骨組織代謝。IGF-1能促進骨和軟骨組織的生長和分化，IGF-2對骨骼生長也有一定的作用，而IGFBP-6可通過減少骨微環境中IGF-2的生物利用度調節成骨細胞的生長[29]。堿性磷酸酶是骨分化的標志物。研究發現，IGFBP-6水平的升高顯著降低了人成骨細胞和成骨細胞樣骨肉瘤細胞堿性磷酸酶的活性，并通過細胞內機制抑制成骨細胞分化[30]。維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)屬于配體依賴的轉錄因子核受體超家族，通過與1,25-二羥維生素D3結合而識別靶基因，調節堿性磷酸酶、生長激素等的表達，參與調節細胞的生長發育、免疫反應、物質代謝等功能[31]。維持骨穩態是VDR的經典功能，其通過促進腸道吸收食物中的鈣而維持體內正常的鈣磷平衡并間接調節骨礦化。IGFBP-6可內化并進入細胞核與VDR結合。與僅轉染VDR的細胞相比，IGFBP-6和VDR共轉染時，1,25-二羥維生素D3與VDR結合介導的骨鈣素和生長激素啟動子的轉錄和表達活性均明顯下降；在1,25-二羥維生素D3存在的前提下，將表達IGFBP-6的質粒瞬時轉染到MG-63和U2-OS細胞中，堿性磷酸酶活性顯著降低；而敲除內源性VDR時，轉染后堿性磷酸酶活性無明顯變化，提示IGFBP-6能夠抑制VDR的轉錄激活活性和細胞對1,25-二羥維生素D3的應答反應，IGFBP-6抑制骨代謝依賴于VDR[32]。

3.4 IGFBP-6與炎癥細胞遷移 受累關節組織內炎癥細胞增多是RA的一個重要特征，是關節炎癥和破壞的關鍵，主要包括B淋巴細胞、T淋巴細胞、RA-成纖維樣滑膜細胞、單核細胞。核因子κB受體激活蛋白配體(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)對破骨細胞的活化起關鍵作用，在外周血的B淋巴細胞中未發現RANKL，滑液和滑膜組織中的B淋巴細胞是RANKL的唯一載體[33]。RA-成纖維樣滑膜細胞被炎癥因子活化后具有“類腫瘤樣”性質，在多種趨化因子的作用下遷移至軟骨表面并侵襲關節面，其是關節破壞的重要環節。目前認為，炎癥細胞增多主要是炎癥細胞募集至受累關節所致，而非局部白細胞增殖[34]。現已明確IGFBP-6能促進膠質瘤、結腸癌等多種腫瘤細胞遷移，并與除腫瘤細胞之外的多種炎癥細胞的遷移有關，提示IGFBP-6可能與RA中細胞遷移機制相關[5-6]。Liso等[35]發現，單核細胞轉化的樹突樣細胞接受高熱(39 ℃)刺激后，IGFBP-6的表達明顯上調。與基質細胞衍生因子-1 (對單核細胞、T細胞以及B細胞均具有趨化作用)陽性對照組相比，IGFBP-6以劑量依賴模式趨化單核細胞，對T細胞亦有趨化作用，且與基質細胞衍生因子-1的作用模式類似，但未發現對B細胞有明顯的趨化作用。近年來研究發現，RA患者的血液中含有IGFBP-6抗體，提示RA體內可能存在IGFBP-6的異常表達[36]。Alunno等[37]的實驗首次直接證實了IGFBP-6與RA的關系,研究發現，規律治療大于6個月的RA患者，血清IGFBP-6的水平較健康對照組明顯升高；雖然在RA滑膜液中也能檢測到IGFBP-6，但水平明顯低于骨關節炎患者，而RA患者滑膜組織中IGFBP-6的水平明顯高于骨關節炎患者。進一步分析發現，滑膜液中IGFBP-6的水平與白細胞計數及血小板計數呈負相關，可能是因為IGFBP-6被白細胞內化及血小板產生的基質金屬蛋白酶-2降解[37]。RA外周血中表達IGFBP-6的T細胞明顯低于健康對照組，而滑膜組織中表達IGFBP-6的T細胞明顯增多[37]。體外實驗發現，遷移至關節滑膜的T細胞大多表達IGFBP-6，提示表達IGFBP-6的T細胞自外周血遷移至關節滑膜[37]。同時，IGFBP-6可作為趨化因子，誘導RA患者的免疫細胞遷移至滑膜，該趨化作用主要作用于CD3+T細胞，并且該趨化作用可被激素部分抑制。體外模擬實驗發現，IGFBP-6誘導中性粒細胞遷移[23]。

4 結 語

RA是臨床上至今無法治愈的疾病，發生、發展過程復雜，涉及細胞的生長、增殖、遷移等各個過程，攻克這一疾病的首要任務是明確發病機制及發病過程中關鍵的調控因子。IGFBP-6可調節細胞的生長、分化、增殖、遷移等過程，目前的研究已經明確IGFBP-6與多種疾病相關，在腫瘤性疾病中受到廣泛關注，可能為抗腫瘤治療提供新的靶點。在RA中IGFBP-6可促進免疫細胞遷移至關節，導致軟骨及骨的破壞，且IGFBP-6可通過抑制VDR的功能抑制骨代謝，可能為RA的研究及治療提供新視角。但IGFBP-6生理功能復雜多樣，可促進細胞遷移參與RA的發病過程，但也能抑制血管新生和成纖維細胞增殖，可能是RA的保護因素，兩者的主導地位決定了IGFBP-6在RA中的最終生物效應，理解兩者的平衡關系至關重要。目前已經發現IGFBP-6相關的細胞表面受體及信號通路，但某些結論尚存在分歧，具體的分子機制仍待進一步探索，以便應用于臨床診斷及治療。