百草枯暴露致帕金森病神經細胞程序性死亡機制研究進展

商躍云，張 慧

(天津市兒童醫院急診科，天津 300134)

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)又稱震顫麻痹，是一種常見的中樞神經系統退行性疾病，其臨床特征主要包括運動性癥狀(靜止性震顫、肌張力升高、運動遲緩和姿勢步態異常等)和非運動性癥狀(焦慮抑郁、睡眠障礙、自主神經功能障礙、嗅覺障礙等)，65歲以上人群PD的患病率約為1.7%，隨年齡的增長，其發病率呈上升趨勢[1]。研究發現，神經細胞尤其是黑質多巴胺能神經元死亡、腦內多巴胺缺乏、黑質紋狀體多巴胺能通路受阻/路易小體形成均對PD的發生發展起重要作用，但具體病因尚不確切[2]。

神經細胞的死亡主要是細胞的程序性死亡，涉及細胞凋亡、自噬樣細胞死亡、細胞壞死死亡等多種類型[3]。病因學研究表明，在所有PD中，遺傳因素所致的家族性PD僅占10%，而環境因素誘發的散發性PD約占90%[4]。百草枯可通過血腦屏障到達黑質紋狀體系統，流行病學和毒理學的研究證明，百草枯的低水平持續暴露可選擇性地破壞黑質紋狀體系統，誘發神經細胞程序性死亡，導致PD，但其機制尚不明確[5]。現就百草枯暴露致PD神經細胞程序性死亡機制的研究進展予以綜述。

1 細胞凋亡

凋亡是多基因嚴格控制的細胞自主有序死亡的主動過程，可維持機體內環境的穩定，以效應分子胱天蛋白酶(caspase)的激活為主要特征。PD的發生發展與神經細胞的凋亡有關[6]。有證據表明，PD患者黑質內的神經細胞凋亡被過度激活[7]。誘導細胞凋亡的途徑主要有死亡受體途徑、線粒體信號途徑和內質網信號途徑以及穿孔素/顆粒酶凋亡信號通路等[8]。

1.1死亡受體途徑 死亡受體途徑是胞外信號誘導的細胞凋亡途徑，也稱外源性凋亡途徑。凋亡相關因子(factor associated suicide，Fas)和死亡受體4/5通過與其對應Fas配體和腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體結合而被激活，然后通過死亡結構域結合到Fas相關死亡結構域蛋白，后者的死亡效應器結構域與死亡受體8/10結合，形成死亡誘導信號復合物，促進死亡受體8/10的自我保護性裂解，從而誘導caspase級聯激活，最終導致細胞凋亡[9-11]。

百草枯誘導的PD發生發展過程中的死亡受體途徑被激活[12-13]。PD小鼠黑質紋狀體中Fas配體和caspase-3的含量上升，在百草枯誘導的小鼠PD模型中，CD4+T細胞通過高表達多巴胺能細胞Fas配體，導致多巴胺能細胞凋亡。在神經元中，Fas誘導的凋亡可被Fas凋亡抑制分子2(Fas-apoptotic inhibitory molecule 2，Faim2)阻止。對中風和細菌性腦膜炎動物模型的研究發現，Faim2缺陷小鼠發生神經退行性病變的概率升高，與非Faim2野生型缺陷小鼠相比，未經處理Faim2缺陷小鼠的多巴胺能系統無明顯變化；Faim2缺陷組經除草劑處理的黑質外側多巴胺能神經元數量減少更明顯；Faim2缺陷組背紋狀體和腹紋狀體多巴胺能纖維密度降低更明顯；經除草劑處理后的野生型非Faim2缺陷小鼠的Fas凋亡抑制分子2的表達下降[14-15]。綜上所述，Faim2缺陷的多巴胺能神經元的變性增加，表明Fas誘導的凋亡可導致PD，而上調Faim2有助于保護神經，提示Fas凋亡通路參與了百草枯誘導的多巴胺能神經元死亡。LRRK2突變是PD最常見的遺傳原因。Ho等[16]提出了富亮氨酸重復激酶2(leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2)激活死亡受體途徑的另一機制。LRRK2含有一個功能性激酶域，最常見的LRRK2致病性突變G2019s可提高LRRK2的活性。LRRK2可調節神經元線粒體的形態和自噬，經脂多糖處理后可增加小膠質細胞中LRRK2的水平，并促進線粒體分裂；下調或抑制LRRK2的活性可減弱小膠質細胞的活化。LRRK2可以激酶依賴的方式，通過選擇性動態蛋白相關蛋白1促進小膠質線粒體的改變，從而刺激促炎反應。活躍的小膠質細胞引起的神經炎癥是局部放電的主要癥狀，可能成為局部放電治療的潛在目標。

1.2線粒體信號途徑 線粒體通路又稱內源性凋亡途徑，由一系列刺激物(包括DNA損傷和生長因子撤退)誘導，在細胞應激反應中被激活，應激信號包括DNA損傷、活性氧類(reactive oxygen species，ROS)及脂質過氧化等，可最終觸發線粒體外膜通透性的改變，其中線粒體外膜通透性的改變通常是某些凋亡前Bcl-2家族成員活化的結果[17]。

線粒體功能障礙導致細胞色素C釋放到細胞質，并與凋亡蛋白酶激活因子1結合形成多聚體，激活caspase-9，進而激活caspase-3等，并使caspase-9和caspase-3等表達增加，而抗凋亡基因表達減少，繼以激活DNA斷裂因子，導致靜息狀態的核酸內切酶活化，最終引起DNA斷裂和細胞凋亡[18]。線粒體外膜通透性的改變由Bcl-2家族成員調節，在線粒體信號途徑中起關鍵作用。Bax和Bak蛋白被激活后，通過線粒體外膜形成孔刺激線粒體外膜通透性的改變和細胞色素C的釋放[19]。

內源性凋亡途徑還包括由凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor，AIF)介導的凋亡途徑，是一種非caspase依賴的凋亡途徑[20]。AIF是一種系統發育保守的線粒體膜間黃素蛋白，細胞接收特異性凋亡誘導信號，觸發線粒體通透性轉換孔的開放，并允許AIF從線粒體釋放到胞質中，隨后AIF與親環素A形成復合物，易位到細胞核，作用于核DNA，影響DNA碎裂，誘導色素溶解和細胞凋亡[21]。除非caspase依賴的凋亡途徑外，AIF還可與細胞色素C以及caspase相互作用，表明不同凋亡途徑可相互交叉調節，激活凋亡程序。

Zhao等[22]發現，百草枯可導致ROS過度生成、細胞色素C釋放增多、線粒體破壞以及細胞凋亡。激活抗氧化途徑可以保護小鼠免受百草枯誘導的氧化應激損傷，使用選擇性動態蛋白相關蛋白1抑制劑抑制線粒體分裂可顯著減弱百草枯誘導的細胞凋亡，可見，線粒體裂變涉及百草枯誘導的細胞凋亡；進一步研究表明，抗氧化劑抗壞血酸可抑制選擇性動態蛋白相關蛋白1線粒體移位和線粒體裂變，并減弱百草枯誘導的細胞凋亡。Han等[23]的研究證實，百草枯可誘導AIF水平升高，介導細胞凋亡，其作用呈劑量依賴方式，且甜菜堿具有抗氧化和抗炎作用，可減輕百草枯誘導的氧化應激，對百草枯引起的細胞凋亡有保護作用。細胞色素C參與α-突觸核蛋白(α-Synuclein，α-syn)自由基形成和寡聚化，表明α-syn參與了蛋白質自由基的形成、生物途徑的改變以及多巴胺能神經元的凋亡。有研究發現，慢性百草枯暴露6周的野生型小鼠的凋亡標志物上調，而PD的典型特征是緩慢的、進行性的神經元凋亡，因此細胞色素C和α-syn介導的累積損傷和延遲凋亡過程更有意義，而α-syn敲除小鼠在長期慢性百草枯接觸后神經元凋亡和紋狀體多巴胺的丟失均減少[24]。

1.3內質網信號途徑 內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)途徑也是內源性凋亡信號通路。內質網是真核細胞的重要細胞器，是蛋白質合成、修飾和轉運到高爾基體的場所。葡萄糖缺乏、缺氧、鈣失衡和氧化應激導致ERS中未折疊或錯誤折疊的蛋白質積累，嚴重時可誘導細胞凋亡[25]。ERS主要通過肌醇需求酶1、雙鏈依賴的蛋白激酶R樣內質網激酶和轉錄激活因子6三種信號傳遞因子激活級聯反應，誘導細胞凋亡[26]。以上三種信號傳遞因子可與免疫球蛋白結合蛋白/葡萄糖調節蛋白78在內質網膜上組成穩定的混合物，而免疫球蛋白結合蛋白/葡萄糖調節蛋白78表達過強則可通過調節Bcl-2家族引起細胞凋亡。此外，當ERS激活c-Jun氨基端激酶時，ROS和Ca2+可通過ERS導致細胞凋亡，被認為是兩種凋亡途徑的交叉[27]。百草枯中毒時，ERS與氧化應激、炎癥反應和細胞凋亡有關[28]。Li等[29]的研究發現，百草枯中毒第7天大鼠海馬葡萄糖調節蛋白78、caspase-3及C/EBP同源蛋白水平明顯上升，細胞凋亡也明顯增加，表明百草枯可誘導中毒大鼠腦組織ERS，調控失敗時導致細胞凋亡，最終導致腦損傷。烏司他丁通過抑制各種酶的活性、清除氧自由基和改善微循環，減輕ERS，抑制caspase-3的表達，進而抑制ERS介導的細胞凋亡，從而發揮其神經保護作用。

1.4穿孔素/顆粒酶凋亡信號通路 穿孔素和顆粒酶都來自細胞毒淋巴細胞和自然殺傷細胞，具有清除病毒感染和(或)癌細胞的能力。穿孔蛋白和促凋亡絲氨酸蛋白酶儲存在細胞毒性分泌顆粒中，與靶細胞形成免疫突觸后，由細胞毒淋巴細胞釋放到突觸裂隙，穿孔素單體通過Ca2+依賴的C2結構域和寡聚酶與靶細胞膜結合，在靶細胞膜上形成跨膜孔。跨膜孔允許顆粒酶被動擴散到靶細胞，引起caspase的激活，導致靶細胞DNA降解及凋亡[30]。穿孔蛋白基因突變或對穿孔蛋白分泌至關重要的基因突變，導致細胞毒淋巴細胞未能傳遞功能性穿孔蛋白，造成致命的免疫調節疾病和(或)癌癥的發生。

神經元特異性T細胞可能進入中樞神經系統，引起神經變性，導致PD。Puentes等[31]對自身免疫介導小鼠神經變性的研究發現，震顫和肌強直小鼠病變區域內CD4+T細胞顯著增多，免疫反應性增強，顆粒酶和穿孔素升高，表明穿孔素/顆粒酶信號通路可導致神經元細胞凋亡。百草枯可導致炎癥因子改變和免疫激活，但尚無顆粒酶和穿孔素改變的相關研究。

2 自噬樣細胞死亡

自噬是細胞將自身細胞質蛋白或細胞器包被進入囊泡，然后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物的過程，藉此實現細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新過程，與細胞凋亡有復雜的相互作用。凋亡和自噬性細胞死亡之間的界限并不完全清楚。細胞凋亡可能以自噬開始，自噬通常以細胞凋亡結束，抑制或阻斷caspase活性可能導致細胞從凋亡轉為自噬性細胞死亡。自噬的激活可反映自噬過程和凋亡過程之間的相互作用。自噬可由許多最終導致細胞凋亡的應激反應誘導，如細胞器功能障礙、代謝應激、細胞萎縮、病原體感染以及饑餓。若相關應激反應誘因得到解決，細胞通常會恢復體內平衡，并恢復初始狀態。若應激反應誘因持續存在，自噬則不能維持細胞存活，細胞可通過激活凋亡途徑做出反應，以確保有效地控制和消除細胞，而不引發局部炎癥。細胞凋亡和自噬之間具有復雜的相互作用，并在細胞死亡所致神經退行性疾病(如PD)的發生發展中起重要作用，為PD等疾病的治療提供了新的思路[32]。

尸檢證據和實驗模型表明，自噬參與神經變性和α-syn-路易小體的形成，此過程與LRRK2的參與有關。LRRK2可促進自噬的發生和自噬體的形成，并損傷自噬降解過程，導致自噬功能障礙以及α-syn清除障礙，還可通過自噬激酶和鳥苷三磷酸酶調節自噬，從而影響線粒體自噬和自噬調節分子，造成細胞毒性，參與多巴胺能神經元變性死亡過程[33]。

研究證實，PD患者黑質紋狀體系統α-syn聚集、路易小體出現以及多巴胺能神經元缺失[5]。PD相關蛋白α-syn、LRRK2、DJ-1蛋白、Parkin蛋白、磷酸酶和張力蛋白同源蛋白誘導的激酶1均參與調節自噬，而1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶、6-羥基多巴、魚藤酮和百草枯等均可導致細胞內自噬體增加。Redmann等[34]將小鼠神經元暴露于α-syn預形成纖維的研究發現，內源性α-syn聚集，進而出現神經細胞死亡。PD病變區域可觀察到神經元自噬的過度激活以及星形膠質細胞的自噬障礙共存。百草枯可通過ERS觸發神經元自噬激活，激活凋亡信號調節激酶1及促分裂原活化的蛋白激酶家族成員；此外，低濃度百草枯可引起星形膠質細胞的自噬損傷或功能障礙，由于細胞質內含物的清除不足和線粒體功能障礙，自噬的抑制加速了百草枯誘導的細胞凋亡，最終導致細胞丟失[5]。星形膠質細胞是神經毒素的第一靶點，強大的抗氧化機制使其成為大腦的第一道防線。長期暴露于百草枯可減少星形膠質細胞的基礎自噬，此效應具有劑量依賴性，并可發生非致死濃度的百草枯中毒。共培養實驗表明，星形膠質細胞自噬的損傷限制了其保護多巴胺能神經元的能力，且具有時間和劑量依賴性[35]。百草枯還可通過減少自噬空泡的生成阻斷自噬，其對星形膠質細胞U33細胞和原代星形膠質細胞自噬的抑制由氧化應激介導，且抑制作用并不局限于基礎自噬。此外，百草枯還觸發了其上游的親自噬信號。

3 細胞壞死死亡通路

3.1壞死性凋亡 壞死性凋亡是指由死亡受體配基啟動、通過死亡受體介導的細胞壞死，不涉及caspase等效應分子，并可被壞死抑素-1特異性阻斷。壞死性凋亡是調節壞死細胞死亡的一種形式，通過激活受體交互作用蛋白1和受體交互作用蛋白3來執行，后者在細胞凋亡不足的情況下被激活[36-37]。壞死性凋亡可由多種刺激引起，但對死亡受體介導的激活，特別是腫瘤壞死因子受體1介導的激活的研究最廣泛。在分子水平上，壞死性凋亡包括受體交互作用蛋白1和受體交互作用蛋白3的自磷酸化和反磷酸化，導致形成淀粉樣多蛋白復合物，即壞死體。此外，混合譜系激酶域樣假激酶由受體交互作用蛋白3招募和磷酸化，并參與壞死性凋亡的過程，磷酸化后的混合譜系激酶域樣寡聚并遷移到細胞膜，導致壞死膜破裂和細胞壞死性凋亡[38]。

有證據表明，壞死性凋亡可促進PD的進一步細胞死亡和神經炎癥。在PD中，壞死抑素-1能阻斷細胞壞死并保護多巴胺能神經元。將6-羥多巴胺誘導的PC12細胞作為PD模型的研究發現，6-羥多巴胺誘導的PC12細胞的線粒體存在功能障礙，壞死抑素-1可增加PC12細胞的活力，穩定線粒體膜電位，但當壞死抑素-1濃度為60 μmol/L和90 μmol/L時，PC12細胞的存活率下降，表明壞死抑素-1對PC12細胞具有雙重作用，低濃度壞死抑素-1對PC12細胞具有保護作用，而高濃度壞死抑素-1對PC12細胞具有毒性[39]。由此可見，對壞死抑素-1的檢測有助于了解PD中壞死抑素-1的作用機制，但目前壞死抑素-1在百草枯致PD中的保護作用機制尚不清楚。

3.2細胞急性壞死 細胞急性壞死所致細胞程序性死亡中，損傷Na+/K+-ATP酶致細胞內鈉超載及線粒體損傷相關的分子模式作為關鍵事件產生的線粒體DNA泄漏，可誘導急性細胞壞死，并介導炎癥反應[40]。細胞急性壞死所致細胞程序性死亡與線粒體損傷有關，且線粒體損傷導致的細胞急性壞死在神經退行性變(如PD)中至關重要。Bir等[41]發現，α-syn積累可致線粒體功能障礙和細胞急性壞死，在PD的發病機制中具有重要意義，而下調α-syn 的表達可以防止乳曲霉素所致SHSY5Y細胞線粒體功能障礙和細胞急性壞死，此外，野生型α-syn 的過表達對氧自由基暴露具有保護作用，但尚未發現對百草枯暴露的保護作用。

3.3聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)-1依賴性程序性死亡 PARP-1依賴性程序性死亡是一類由PARP-1介導的不依賴caspase的細胞死亡，其機制明顯依賴于線粒體相關AIF的核易位，此種核易位由PARP-1過度活化引起，可引發大規模的DNA斷裂和染色質濃縮，最終導致細胞死亡[42-43]。PARP-1過度激活還導致大量聚ADP核糖合成并在細胞內積聚，細胞內煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和ATP耗竭。聚ADP核糖可導致線粒體內AIF釋放，并促進AIF進入細胞核，誘導細胞死亡，其特征為大規模DNA片段化和染色質縮合[44]。PD患者的中腦聚ADP核糖明顯升高，表明PD患者中腦PARP存在過度激活。對PD小鼠模型的研究表明，PARP-1依賴性程序性死亡在緩慢進展的多巴胺能神經元變性中占主導地位，而百草枯暴露導致細胞內Ca2+內流和線粒體功能障礙，進而激活一氧化氮合酶，使一氧化氮產生氧亞硝基陰離子，導致PARP-1的過度激活、DNA損傷及神經元PARP-1依賴性程序性死亡[45]。PARP表達下降或活性抑制能抑制小鼠黑質多巴胺能神經元發生PARP-1依賴性程序性死亡。Tuncer等[46]的實驗證實，百草枯可致PARP的過度激活，而百草枯暴露后使用PARP抑制劑有助于降低百草枯的毒性。

3.4鐵死亡 鐵死亡主要是細胞內脂質ROS生成與降解的平衡失調，引起鐵依賴性脂質ROS的堆積。當細胞抗氧化能力降低，脂質ROS堆積，即可引起細胞氧化性死亡，即鐵死亡。鐵死亡可以被多種化合物所誘導，其上游通路均通過直接或間接影響谷胱甘肽過氧化物酶的活性降低細胞的抗氧化能力，致使脂質過氧化反應增加，ROS增多，引起鐵死亡。鐵是鐵死亡過程的必要條件，各種鐵螯合劑均能抑制細胞的鐵死亡；相反，補充鐵離子可以加速鐵死亡。鐵離子在細胞鐵死亡中的確切作用至今仍不明確，可能與電子傳遞以及ROS的生成有關[47]。

研究表明，PD的發病與鐵死亡和ROS相關[48-49]。PD中存在鐵積累和脂質過氧化，并伴隨谷胱甘肽和谷胱甘肽過氧化物酶4的減少，鐵的沉積加劇了谷胱甘肽和谷胱甘肽過氧化物酶4的減少，而鐵抑制素-1、利血抑制素-1和內源性維生素E等自由基清除劑則可防止谷胱甘肽和谷胱甘肽過氧化物酶4的減少。鐵中毒終止于線粒體功能障礙和毒性脂質過氧化，兩者均在PD的發生發展中起重要作用。另有研究發現，鐵死亡抑制因子(如利樂司他丁)可以保護神經元，恢復動物模型的認知功能[50]。鐵死亡抑制劑可以有效地抑制百草枯誘導的SH-SY5Y細胞死亡。百草枯接觸前注射鐵死亡抑制劑至小鼠腦內可以減輕因百草枯毒性導致的黑質多巴胺能神經元的丟失[50]。

4 小 結

百草枯可通過激活死亡受體途徑、線粒體信號途徑及內質網信號途徑等促進細胞凋亡，神經元自噬的過度激活加速了百草枯誘導的細胞凋亡，而星形膠質細胞的自噬障礙限制了其保護多巴胺能神經元的能力，壞死性凋亡、細胞急性壞死及鐵死亡等均參與了百草枯致PD的程序性死亡的發生發展。對百草枯致PD程序性死亡的進一步研究將為PD的治療提供新靶點和理論依據，為降低PD發病率、改善PD診療現狀、提高PD患者的生活質量、改善患者預后提供幫助。