Rab6蛋白的結構和功能

王 芳，楊俊俊，徐興祥

(江蘇省蘇北人民醫院呼吸內科 揚州大學臨床醫學院, 江蘇 揚州 225001)

Rab蛋白是一類小分子鳥苷三磷酸(guanosine triphosphate,GTP)結合蛋白，由200個左右的氨基酸組成，相對分子量為20 000～30 000。Rab蛋白具有一些共同的結構特征，即由保守的G結構域和高度可變的N端和C端組成。G結構域有5個α螺旋(A1～A5)、6個β片層(B1～B6)和5個多肽環(G1～G5)，5個多肽環具有高度保守的氨基酸序列，能連接α螺旋和β片層[1-2]。目前為止,在人類中已發現70多種Rab蛋白，酵母中發現約11種。Rab蛋白普遍存在于所有真核生物中，作為各細胞器之間囊泡運輸的分子開關，在真核細胞中Rab蛋白參與幾乎所有的細胞膜運輸過程，并且通過與各種效應器的結合，進一步影響細胞的增殖、分化、凋亡，進而決定細胞的生命進程[3-4]。Rab家族成員之間的氨基酸序列有75%～95%的相似性，其中包括Rab6。Rab6是一個與高爾基體相關聯的GTP酶，是Rab成員之一，具有Rab中最低的GTP酶活性，其水解活性為5×10-6/s[5-6]。Rab6能通過與各種效應因子相互作用，對細胞內物質轉運不僅起調控作用，而且也發現與病原體吞噬、神經元的功能、有絲分裂等有關[7-9]。此外也發現Rab6與多種疾病的發生發展關系密切[10-11]。現從Rab6的結構、效應因子以及在不同疾病中的發揮的功能方面，闡述Rab6蛋白。

1 Rab6的亞型

Rab6與Ras、Rho和Ran亞家族屬于Ras超家族,是Ras超家族的一個分支，與Ras保持 30%～60%的同源性[5]。蛋白質組學分析顯示，Rab6含有豐富的與高爾基體相關聯的Rab蛋白，主要定位于反式高爾基體腔和管網狀結構的膜上[12-14]。目前Rab6蛋白在高爾基體膜上定位的具體機制尚不十分明確。現有研究表明，Rab6的定位主要取決于N端的71種氨基酸，而C端的多態性也可能有一定作用[15]。目前在人類中已發現4種Rab6的亞型：Rab6A、Rab6A′、Rab6B和Rab6C(也稱為WTH3)，而大多數生物體，如果蠅，僅有1種Rab蛋白[3]。

Rab6A和Rab6A′是最早發現的Rab6異構體亞型，由同一基因選擇性剪切而來。有研究發現Rab6A′和Rab6A的差異僅存在于PM3保守結構域(GTP-結合結構域)兩側的3個氨基酸之間，即Val62→lle和Thr87/Val88→Ala/Ala。Rab6A′和Rab6A定位于第11號染色體。經逆轉錄-聚合酶鏈反應技術檢測發現，Rab6A′和Rab6A在組織中廣泛表達，并且無明顯表達差異，但在膜的轉運過程中行使功能不同，具體功能尚不明確[16-17]。Rab6B亞型是一個由Rab6A′和Rab6A非剪接的復制基因，氨基酸序列與Rab6A′和Rab6A有91%的相似，只在C端存在差異。Rab6B定位于第3號染色體，在高爾基體上大量表達。有研究表明，Rab6B在神經系統中特異性表達，但其余的Rab6亞型在神經元中也有表達[10-19]。Rab6C作為Rab6的新亞型被發現，擁有單一的外顯子結構，是一種靈長類動物特定的逆基因。因Rab6C由RAB6A′mRNA反轉錄而來，曾被命名為RAB6A′[20]。Rab6C定位在第2號染色體上，在哺乳動物多種組織中均有表達，現已在乳腺、大腦、睪丸、前列腺組織中發現，但由于其轉錄數量有限，所以內源性Rab6C含量較低，呈現低表達。并且研究發現，過表達的Rab6C會使細胞在有絲分裂第一間隙期即G1期發生停滯[21]。

2 Rab6蛋白的效應因子

與其他GTP酶一樣，Rab6蛋白具有兩種形式，鳥苷二磷酸(guanosine diphosphate，GDP)為失活形式，GTP為活性形式，在發揮功能時不斷進行GTP/GDP循環。當Rab6蛋白結構域上的GDP被GTP替代時，Rab6蛋白激活，活化后的Rab6-GTP通過激活和招募細胞內Rab6的多種效應因子，對早期內涵體的再循環、胞吞和早期內涵體融合等起調節作用[18]。目前多種Rab6蛋白效應因子經酵母雙雜交和免疫共沉淀等方法發現，例如Rab驅動蛋白-6(Rabkinesin-6)、肌凝蛋白Ⅱ、動力蛋白-動力蛋白激活蛋白(dynein-dynactin)復合體、GTP酶激活蛋白、Rab6相互作用蛋白1(Rab6-interacting protein 1,Rab6IP1)、Rab6相互作用蛋白2(Rab6-interacting protein 2,Rab6IP2)、β淀粉樣前體蛋白結合蛋白3等[22]。

Rabkinesin-6定位在高爾基體上，與Rab6A相互作用，能夠參與高爾基體沿微管到內質網的反向運輸。雖然Rabkinesin-6不能與Rab6A′相互作用，但沉默Rab6A′或Rab6A后，高爾基體形態會發生改變，從而影響高爾基體-內質網循環[18]。一種特殊的肌凝蛋白Ⅱ，作為Rab6效應蛋白，能參與囊泡在高爾基體管網狀結構上的轉運[23]。Miserey-Lenkei等[24]發現Rab6A′/A在活性狀態下能直接將肌凝蛋白Ⅱ招募到高爾基體上，在肌動蛋白(actin)的協助下完成囊泡的分裂。

Bicaudal-D(BICD)和dynein-dynactin復合體同作為Rab6的效應蛋白，當BICD被位于高爾基體上的Rab6識別后，通過與pl50Glued互相作用，招募dynein-dynactin復合體到高爾基體上，從而介導高爾基體和內質網之間的運輸。pl50Glued作為dynactin復合體的一個亞基，與Rab6A′/A作用后和微管相連，使囊泡能夠在微管上移動，最后通過效應蛋白Rab6IP2協助囊泡與細胞膜錨定融合。雖然Rab6A′/A參與到高爾基體-內質網之間的運輸，但Rab6A并不是必需的[18]。

3 Rab6蛋白的功能

3.1Rab6調控細胞吞噬 細胞吞噬是生物體最基本的防衛機制之一，是宿主消化病原的直接途徑。細胞吞噬是單細胞動物攝取營養物質的主要途徑，但是在多細胞動物中，部分細胞特化為吞噬細胞，能利用吞噬作用來殺死和消除病原體以及損傷組織，來保持自身的穩定和對外防御[25]。吞噬是一個動態的過程，主要由于actin的聚集導致細胞膜結構的改變引起。而actin的聚集是由于小G蛋白的磷酸化傳導信號介導的[26]。由此可以看出，小G蛋白家族在細胞吞噬中起到了重要的作用。在對蝦抗病毒免疫研究中發現，當Rab6蛋白優先與對蝦白斑綜合征病毒的膜蛋白VP466(對蝦白斑綜合征病毒的膜蛋白)結合時，導致actin聚集，進而增強細胞吞噬活性，抑制病毒感染；但是當原肌球蛋白優先和VP66蛋白結合時，actin構象朝利于病毒感染的方向變化，進而促進病毒感染[27-29]。進一步研究發現，在對蝦血淋巴細胞和果蠅S2細胞中發現，Rab6通過與actin相互作用影響actin骨架的構象來調控吞噬[28]。由此推測Rab6蛋白在無脊椎動物吞噬過程中起作用。為探究Rab6蛋白是否在哺乳動物吞噬過程中起作用，Chen等[9]用小鼠巨噬細胞株RAW264.7為實驗對象，利用小干擾RNA沉默基因，發現當Rab6被敲低時，巨噬細胞對金黃色葡萄球菌消化率下降，而Rab6過表達時使消化率提高20%。由此說明Rab6調控巨噬細胞`殺死和消化金黃色葡萄球菌過程中起積極作用。此研究還證實，BICD1在作為BICD的同源異構體的同時，也作為Rab6的效應蛋白，與Rab6行使相同的功能，參與物質在細胞膜之間的轉運，且在吞噬小體的成熟過程中起作用。

3.2Rab6與神經元功能 神經元是神經系統的結構和功能單位，能夠接受、整合和傳遞信息。兩個神經元之間或神經元與效應器細胞之間通過突觸相互聯系。為了識別影響突觸特異性的新成分，Tong等[8]通過在果蠅眼睛中進行正向基因篩選，發現rich蛋白在突觸形成識別過程中起作用。當rich蛋白缺失后，受體細胞中神經鈣黏素會隨之減少，此時神經元突觸形成就缺乏了特異性。而Rab6蛋白能調節神經鈣黏素的運輸，當rich蛋白激活Rab6蛋白時，對突觸正常的形成有影響。由此說明Rab6與果蠅視覺神經系統的發育過程有關。

Schlager等[30]發現BICD相關蛋白1(BICD-related protein 1, BICD-R1)也是Rab6的效應蛋白，同時是一個序列與BICD同源的蛋白，與神經元發育過程中囊泡的轉運有關。在神經元分化早期，BICD-R1表達量很高，將Rab6分泌小泡聚集在中心體周圍，既能阻止Rab6分泌小泡運輸到神經突，又能防止神經元過早成熟。在神經元分化后期，BICD-R1表達量明顯減少，允許Rab6分泌小泡順行運輸到神經突，促進神經元成熟。

科恩綜合征相關蛋白-1(Cohen syndrome-associate protein 1, COH1)作為骨架蛋白在高爾基體功能及形態的維持中起重要作用。Seifert等[10]用小干擾RNA干擾Rab6A和Rab6A′表達時，發現干擾Rab6A和Rab6A′表達會阻止COH1定位到高爾基體上，說明COH1可能是Rab6的效應蛋白之一。此實驗還證實單獨降低COH1或Rab6的表達會影響神經系統的發育，說明在神經系統發育過程中Rab6 和CHO1起到了一定的作用。

3.3Rab6調控有絲分裂 細胞分裂有多種不同分裂方式，而有絲分裂是其中一種。真核細胞能通過有絲分裂產生體細胞。細胞有絲分裂是一個連續的過程，且具有周期性并受到嚴格的調控，整個分裂過程分為前期、中期、后期和末期。當敲除細胞中Rab6A′時，有絲分裂中期出現阻滯，說明有絲分裂的正常運行需要Rab6A′的參與。當Rab6A′功能異常時，Mad2作為紡錘體檢查點蛋白被激活，導致有絲分裂在細胞中期停滯，說明Rab6A′能運輸Mad2蛋白脫離著絲粒，使細胞分裂進程繼續[7]。

Rab6 GAP CenA作為Rab6的效應蛋白，多數位于細胞質中，少數位于中心小體上，在細胞間期起作用，與胞質γ-微管蛋白形成復合體后，對微管的成核起到一定作用。Rab6A′能通過GTP酶激活蛋白互相作用參與細胞分裂中期到后期的轉換[7,31]。

Rabkinesin6作為Rab6的驅動蛋白，分裂后期在紡錘體中部聚集，分裂末期聚集在溢裂溝和中間體上，在細胞分裂期表達量增多，與Rab6A相互作用參與細胞有絲分裂。Rabkinesin6過表達會引起細胞分裂缺陷，從而導致細胞死亡[32]。

有研究顯示，Rab6不僅影響果蠅卵母細胞的極性，而且參與果蠅卵母細胞的發生，介導mRNA與細胞骨架的運輸。Hou等[33]和Ma等[34]敲低小鼠卵母細胞中的Rab6A時，細胞培養發現，卵母細胞第一極體(pb1)排出率較對照組明顯下降；激光共聚焦結果顯示，Rab6A影響染色體的中板排列。由此推測Rab6A與卵母細胞減數分裂有關。此外，這些研究還證實Rab6A能夠顯著影響減數分裂過程中皮質顆粒和內質網的分布。由此推測，Rab6A的敲低可能通過影響囊泡向膜及內質網的運輸，從而造成皮質顆粒和內質網異常。

4 Rab6與相關疾病

微RNA(microRNA，miRNA)在腫瘤近年的研究中受到了較多關注。miRNA發揮著類似癌基因和抑癌基因的作用，能調控個體的生長發育、細胞增殖和凋亡、細胞分化等各項生命活動。通過改變miR-5100 和miR-218的下游靶基因Rab6的表達，其能發揮抑癌基因的作用。Huang等[11]在肺癌細胞系A549和H1299中發現miR-5100表達明顯增加，體外實驗表明，過表達miR-5100會導致Rab6表達下降，從而促進細胞的增殖與克隆的形成。該實驗還發現miR-5100與Rab6的3′非翻譯區結合，導致Rab6表達下降，從而發揮致癌基因的作用。何龍等[35]在腎癌細胞系A498和769-P荷瘤裸鼠時發現，在裸鼠中過表達miR-218時，荷瘤后腫瘤的生長較慢，體重降低速度減慢。組織學檢查發現，Rab6C的表達較對照組明顯減少，說明miR-218能通過Rab6C調控腎癌細胞，且Rab6C與miR-218的表達呈負相關。

化療耐藥是目前惡性腫瘤臨床治療失敗的主要原因之一。Rab6蛋白與腫瘤耐藥相關。Shan等[20]研究發現，在多重耐藥子宮肉瘤細胞株中，降低Rab6的表達，會增加對阿霉素的敏感性。但對HEK293細胞的研究發現，降低Rab6表達時，其對阿霉素的耐藥性比野生型增高3～7倍，然而增加Rab6表達時卻會促進HEK293細胞凋亡[36]。Tian等[37]從乳腺癌患者胸腔積液中分離的耐藥細胞株及原代腫瘤細胞，在體外對Rab6C進行甲基化修飾，發現耐藥的細胞株轉為對化療藥物敏感的細胞系。近來在肺癌干細胞系A549和H1299研究中發現，miR-5100可以抑制Rab6的表達，從而降低對順鉑的敏感性[38]。

上述研究提示，在多種腫瘤研究中，Rab6的表達各有不同，但目前多數結果提示在腫瘤細胞中降低Rab6表達，能夠促進腫瘤細胞的增殖和克隆[11,36,38]。但陳玉磊[39]為了探索Rab6蛋白是否對巨噬細胞分泌細胞因子產生影響，進而影響腫瘤的形成和發展，將巨噬細胞中的Rab6敲低后與腫瘤細胞共培養，結果顯示巨噬細胞中的Rab6蛋白對腫瘤的遷移等過程無顯著影響。由此，猜測Rab6蛋白可能對于腫瘤的形成與發展并沒有直接關系。

阿爾茨海默病是累及中樞神經系統的神經元變性疾病，病理特征為神經元數目減少、β淀粉樣蛋白沉積形成老年斑、神經元纖維纏結、海馬錐體細胞顆粒空泡變性等[40]。McConlogue等[41]發現降低Rab6的表達會抑制β淀粉樣蛋白的形成，說明Rab6與阿爾茨海默病之間存在某種聯系。并且目前有研究發現，阿爾茨海默病患者腦中Rab6的表達量是正常人的5倍，Rab6與內質網應激之間存在一定關聯，當阿爾茨海默病患者腦中Rab6表達下降時會激活內質網應激，但過表達會減弱內質網應激[42-43]。上述研究提示Rab6可能通過調控內質網應激的過程導致阿爾茨海默病的發生，具體機制有待進一步研究。

5 展 望

Rab蛋白通過與效應子結合完成囊泡在各細胞器間的轉運，但這些效應蛋白如何在不同的細胞器上被識別，是否還有未發現的效應蛋白，Rab6除了在調控細胞自噬、影響神經系統的發育、調節有絲分裂方面起作用外，還有哪些功能仍有待進一步的探究。此外，Rab6蛋白不僅參與了多種腫瘤細胞的遷移、增殖、凋亡，信號轉導以及藥物耐受，并且在阿爾茨海默病患者中也起一定的作用，但Rab6蛋白在疾病發生及發展過程中的具體機制尚不清楚。因此，Rab6蛋白新的功能及作用機制仍有待于進一步探索。