間充質干細胞及其來源的細胞外囊泡在類風濕關節炎中的研究進展

衛 春，許 珂，張莉蕓

(1.山西醫科大學研究生學院，太原 030001； 2.山西醫學科學院 山西大醫院風濕免疫科，太原 030032)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA) 的發病機制主要包括免疫紊亂、組織細胞損傷及骨破壞。其發病率及致畸、致殘率呈逐年上升趨勢，嚴重影響患者生活質量，已成為全球健康保健的重要問題之一。目前，RA的治療主要以緩解癥狀、減少并發癥為主，但其臨床緩解率僅達50%左右[1]。大量基礎研究表明，間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可有效改善RA動物模型膠原誘導性關節炎大鼠的關節腫脹度，抑制免疫細胞及炎癥細胞因子，促進組織修復[2-6]。但MSCs來源有限，且靜脈輸注可致心律失常、體內異位成骨、成瘤等潛在風險限制了其臨床應用。而進一步研究發現，細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)可介導細胞間的信號傳達，釋放生物活性物質、信使RNAs、微RNAs(microRNAs，miRNAs)等。EVs依據細胞來源不同發揮各種功能，且通過不同機制與受體細胞相互作用，如與靶細胞質膜融合，或通過內吞作用內化，或與細胞表面受體相互作用，誘導細胞內信號轉導通路等[7-9]。由于間充質干細胞來源的細胞外囊泡(extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells，MSC-EVs)可模擬其母體細胞發揮治療作用，且可規避細胞療法的潛在風險，故MSCs-EVs逐漸成為研究熱點。現就MSCs及MSCs-EVs在RA中的研究進展予以綜述。

1 MSCs特性

MSCs是來自骨髓、脂肪、牙髓和臍帶等各種組織的成熟干細胞，其中具有治療作用的主要來源于骨髓和脂肪組織，其可分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞[10]。此外，MSCs還可通過分泌生長因子、細胞因子、趨化因子等多種營養因子，發揮抗炎、促增殖、抗凋亡、抗纖維化、促血管生成作用[7]。

MSCs的分化潛能和旁分泌功能，使其與骨軟骨缺損、骨關節病的軟骨修復和組織重建密切相關。MSCs在特定培養基條件下分化為軟骨細胞，并產生分泌軟骨細胞外基質的分化細胞，分化的軟骨細胞性能接近原始透明軟骨。為獲得更多功能成熟的軟骨細胞，在臨床前動物模型中，Vinatier等[11]研制出多種方法將MSCs與仿生支架和生長因子相結合，以支持軟骨細胞分化，形成功能性透明關節軟骨。

MSCs的抗纖維化作用被證明是通過肝細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和腎上腺髓質的產生來介導[12]。在損傷組織中，MSCs通過產生抗氧化分子發揮抗氧化應激作用，如血紅素加氧酶1和促紅細胞生成素[13]。當暴露于炎癥環境時，MSCs可以發揮抗炎作用，即腫瘤壞死因子-α、白細胞介素(interleukin，IL)-1β或IL-1α等炎癥因子激活MSCs，使其獲得免疫抑制特性，調節固有免疫系統和適應性免疫系統，抑制CD4+和CD8+T細胞的增殖、分化，誘導CD4+CD25+叉頭/翼狀螺旋轉錄因子3+調節性T細胞(regulatory T cell，Treg細胞)產生[14]。此外，MSCs還可通過抑制Toll樣受體的活化和誘導耐受性IL-10的產生，抑制樹突狀細胞活化和成熟，并通過誘導炎癥M1型向M2型巨噬細胞亞群的轉化，抑制自然殺傷細胞活化[15]。這些免疫抑制功能由接觸依賴性機制介導，主要調節炎癥介質的釋放，如吲哚胺2，3-雙加氧酶、一氧化氮、IL-6、前列腺素E2、腫瘤壞死因子-α、腫瘤壞死因子誘導基因6、人類白細胞抗原G5、IL-1受體拮抗劑等[16]。可見，MSCs通過分泌和旁分泌機制產生大量介質，在風濕性疾病，尤其是RA患者的治療中具有重要的應用價值。

2 MSCs與RA

RA是一種慢性自身免疫性疾病，以滑膜炎癥為特征，導致關節軟骨漸進性破壞。其發病率高，致殘性強[1]。研究發現，免疫細胞在RA的發生發展中起核心作用，且針對免疫細胞為治療靶點的生物制劑在一定程度上提高了RA的臨床緩解率，特別是對難治性RA患者，但約30%的患者仍無效[17]。此外，生物制劑價格昂貴，存在誘發腫瘤、結核等感染性疾病的風險，且停藥后病情容易復發。

目前RA的發病機制尚不清楚，研究多集中在炎癥通路、趨化因子通路及骨破壞通路，其中炎癥通路在RA中發揮重要作用。研究發現，輔助性T細胞(helper T cell，Th細胞)1和Th17細胞是導致RA發病的核心T亞群[18]。在RA患者中，由Th1細胞分泌的腫瘤壞死因子-α、IL-1、IL-2、γ干擾素及Th17細胞產生的IL-17、IL-6等炎癥因子水平升高；而Th2細胞、Treg細胞產生的抗炎因子(IL-4、IL-10、IL-35和轉化生長因子-β等)水平降低[19]。因此，Th1/Th2及Th17/Treg的失衡與RA的發生、發展密切相關，而IL-1、腫瘤壞死因子-α被認為是RA發病的重要促炎細胞因子，IL-10、腫瘤壞死因子-β為重要的抗炎細胞因子。B細胞可以分泌包含類風濕因子在內的各種自身抗體，在RA的發病中發揮重要作用。研究證實，骨髓、脂肪、滑膜、臍帶等來源的異基因MSCs移植對膠原誘導性關節炎大鼠具有治療作用[20]。針對RA動物模型膠原誘導性關節炎大鼠的研究發現，骨髓來源的MSCs移植不僅可改善膠原誘導性關節炎大鼠關節癥狀、影像學及病理表現，還可抑制T、B細胞增殖，上調Treg細胞、下調Th17細胞水平，抑制促炎因子(腫瘤壞死因子-α、IL-1、IL-17)的表達[3-5]。因此，MSCs在炎癥性關節炎中發揮抗炎作用，其可能成為治療RA的新細胞治療方案。但MSCs在體內有導致毛細血管阻塞、異位成骨等潛在風險，故使其臨床應用受限。且有研究顯示，MSCs治療RA無明顯改善，這可能與動物遺傳背景有關，也可能與永生化小鼠骨髓間充質干細胞有關[21]。

3 MSC-EVs與RA

3.1EVs EVs是磷脂雙分子層包繞形成的異質性膜分泌體，幾乎所有類型的細胞均可分泌，其存在于各種生物體液(血液、尿、唾液、腦脊液、母乳和其他)中。依據大小、組成和來源不同，EVs可分為外泌體、微粒(或泡)和凋亡小體[22]。其中，外泌體是由多微囊泡內體與細胞質膜融合釋放的EVs，其直徑為40～100 nm。微粒也叫微囊泡，是細胞受刺激或應激(缺氧誘導)產生的EVs，當磷脂不對稱分布或細胞骨架重組后微囊泡直接從細胞質膜脫落，直徑為100～1 000 nm，其表達親代細胞膜表面受體。凋亡小體是EVs的第三種主要類型，直徑>1 000 nm，誘導晚期細胞死亡的小泡。在病理情況下，微囊泡可能有致病作用，并促進疾病的進展，反過來其也可能保護和防止疾病的發展。 與其他細胞類型類似，MSC-EVs可通過傳遞信息與其他細胞相互作用來模擬其母體細胞的作用，發揮免疫調節、促進組織修復及再生作用[23-25]。

3.2MSC-EVs在RA中的免疫調節作用 在RA、骨關節炎、自身免疫性腦脊髓炎等炎癥疾病中，MSCs的免疫調節作用備受關注。雖然MSC-EVs在RA臨床前模型中的治療效果報道較少，但一些體外研究已證實了MSC-EVs的免疫調節作用[23,26-27]。MSC-EVs治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎的研究顯示，MSC-EVs具有免疫抑制作用，其可以減少 T細胞的增殖，增加IL-10、轉化生長因子-β1的產生，促進細胞凋亡；同時，MSC-EVs也可促進CD4+CD25+Treg細胞的產生，半乳凝素1和膜結合轉化生長因子-β1的表達，這些均是參與免疫耐受的關鍵分子[23]。另有研究證明了MSC-EVs對T亞群的免疫調節作用，當人臍帶MSCs來源的EVs與活化的脾臟組織勻漿共培養時，Th17細胞數量減少、IL-17 水平降低，叉頭/翼狀螺旋轉錄因子3+Treg細胞數量增加[26]。Blazquez等[27]研究證實，與MSC-EVs共培養的T細胞，其活化和分化被阻止，這與CD4+T細胞產生的γ干擾素減少有關。此外，MSC-EVs也可以減少B細胞增殖和分化，使免疫球蛋白的分泌減少[28]。然而有學者指出，MSC-EVs產生的免疫抑制效果較MSCs弱，且隨著MSC-EVs水平降低，其對T細胞增殖的抑制作用減弱[29]。可見，MSCs和MSC-EVs均可以發揮免疫調節作用，且MSCs的免疫調節作用部分是由EVs釋放調控分子介導。

3.3MSC-EVs在RA中的再生作用 MSC-EVs具有再生作用，包括促血管生成、抗凋亡、抗纖維化、促增殖，其已在一些動物模型中進行研究，包括心肌梗死、腦梗死和急性腎損傷等[30]。關于MSC-EVs的促血管生成活性，有研究表明，其可通過促血管生成效應保護缺血再灌注損傷的腎損傷[24]。基于精準分辨率的等電聚焦耦合液相色譜-串聯質譜的蛋白組學分析顯示，MSC-EVs不僅包含生長因子，如表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、血小板衍生生長因子等，還含有核因子κB信號通路，這些均可促進血管的生成[31]。MSC-EVs中的蛋白質因子與靶向血管內皮細胞膜相互作用，通過細胞融合延遲信使RNAs的傳遞，最終誘導形成毛細血管樣結構[32]。

MSC-EVs的增殖效應在不同的模型，特別是皮膚修復中被研究。在皮膚損傷修復過程中，MSC-EVs 能被成纖維細胞吸收并內化，以促進細胞遷移、增殖和膠原產生[33]。且四氯化碳誘導的肝損傷可通過MSC-EVs分泌的增殖細胞核抗原增加，促使肝細胞增殖[25]。在急性心肌梗死大鼠模型中，MSC-EVs干預后心臟功能得到明顯改善[34]。這是因為MSC-EVs可加速內皮細胞生成和轉移，促進血管形成。

MSC-EVs不僅具有促增殖作用，還有明顯的抗凋亡能力。如當骨肉瘤細胞與MSC-EVs共培養時，MSC-EVs通過運輸轉移相關基因表現出明顯抗凋亡作用，包括單羧酸轉運蛋白、骨形態生成蛋白2、成纖維細胞生長因子7、基質金屬蛋白酶-1和黏著斑激酶1[35]。另一項對順鉑干預的人腎小管上皮細胞凋亡體外模型進行的研究發現，MSC-EVs 可上調抗凋亡基因，如B細胞淋巴瘤/白血病-xL、B細胞淋巴瘤/白血病-2和人桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復序列8，抑制可誘導細胞凋亡的基因，如胱天蛋白酶(caspase)1、caspase-8和淋巴毒素α[36]。在結腸炎中，MSC-EVs通過減少caspase-3、caspase-8和caspase-9的裂解抑制細胞凋亡[37]。在單側輸尿管梗阻腎損傷中，MSC- EVs通過調節miRNAs表達，包括miR-299、miR-499、miR-302和miR-200c，發揮重要的抗凋亡作用[37]。MSC-EVs通過在體內外下調凋亡信號增加腎臟細胞的生存概率。

Li等[38]的研究表明，MSC-EVs具有抗纖維化作用。MSC-EVs可通過減少肝臟組織中的膠原沉積，肝臟中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白和轉化生長因子-β1的表達，及肝纖維化信號轉導中白細胞抑制因子2的磷酸化減輕四氯化碳干預的肝纖維化肝炎。同樣，在甘油或順鉑引起的腎損傷中，MSC-EVs可減輕腎纖維化，恢復腎功能[39]。在這些模型中，MSC-EVs 改善了氧化應激和減少細胞凋亡，最終增加細胞增殖。

MSC-EVs具有與親代MSCs類似的再生、抗凋亡、抗纖維化和抗炎功能，為其母體細胞在治療RA方面的應用提供了新視角。但關于MSC-EVs治療RA國內外研究較少。Zhang等[40]的研究證明，在免疫功能低下的大鼠骨軟骨缺損模型中，MSC-EVs 可促進軟骨再生，且注射EVs可加速組織填充、Ⅱ型膠原基質的合成和增強黏多糖硫酸化，12周后，經MSC-EVs干預的大鼠軟骨和軟骨下骨完全愈合[40]。該研究證明了MSC-EVs在體內促進軟骨修復的有效性。

4 小 結

EVs維持著細胞之間的通訊，并在組織再生過程中發揮重要作用。但目前對EVs信使作用的認知仍處于初始階段。此外，不同類型的EVs的具體作用尚未明確，影響外泌體或微泡合成和釋放的因素尚未確定。但EVs在風濕性疾病病理生理學中的重要作用，及其作為RA生物標志物的可能性值得進一步研究。同時，不同細胞分離的EVs治療的有效性需要在不同的臨床前模型中被評估。雖然MSC-EVs已被證明可能有助于MSCs更好地發揮治療作用，其可能是RA治療的新手段之一，但對于MSC-EVs在風濕性疾病的治療仍研究較少，未來需進一步探討。