混合鹽堿脅迫對藜麥種子萌發和幼苗抗氧化特性的影響

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(甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070)

藜麥(Chenopodiumquinoa)為莧科藜屬植物，起源于南美洲安第斯山脈沿麋地區，距今約有5000～7000年的栽培歷史，是當地印加人備受推崇的傳統食物之一。因藜麥富含豐富的蛋白、氨基酸種類、膳食纖維、維生素、礦物質及不飽和脂肪酸，被聯合國國際糧農組織(FAO)推薦為“全營養食品”。其在預防肥胖、心血管疾病、糖尿病乃至癌癥等方面的功效已得到認可[1]，使其從一種冷門的傳統谷物成為全球炙手可熱的商品，僅依靠原產地并不能滿足日益增加的需求。由于藜麥具有抵御土壤貧瘠[2]、鹽漬[3]、干旱[4-5]和霜凍[6]等逆境的生物學特性，被廣泛引種栽培到美國、加拿大和歐洲等多個國家和地區[7-8]，目前在我國西藏、陜西、甘肅、青海、寧夏等地均有種植[8]。我國西北高原地區的自然環境為藜麥的引種栽培提供了良好的條件，但此地區因雨水少，微弱的淋溶作用致使大部分土壤呈堿性反應，在低洼灌溉區以及地下水位較高地段，地下水可由毛管作用將鹽分帶到地表聚集，使土壤發生鹽漬化[9-10]，嚴重制約農業生產。因此，研究鹽堿脅迫下藜麥耐鹽堿機制，對解決藜麥適應性栽培具有理論指導和現實意義。

目前，國內外對藜麥抗逆的研究主要集中在抗鹽方面，劉文瑜等[11]研究發現低于200 mmol·L-1NaCl溶液能促進藜麥種子萌發，隨鹽度增加藜麥幼苗莖部生長受到抑制，低濃度鹽脅迫可增加藜麥幼苗葉片滲透調節物質含量，增強抗氧化酶活性，清除多余活性氧。楊宏偉等[12]認為低濃度鹽脅迫可促進根的生長以增強根系吸水抵抗滲透脅迫。張紫薇等[13]研究發現藜麥的耐鹽性強于耐旱性，低濃度鹽處理復水后，幼苗側重對莖生物量的分配，對根生物量分配較少，高濃度鹽處理復水后對根造成永久傷害不能恢復至對照水平。Shabala等[14]研究發現遭受鹽脅迫時藜麥降低葉片氣孔密度以得到最佳水分利用效率。通過積累無機離子(Na+、K+、Cl-)進行滲透調節，以維持正常所需水勢，降低蒸騰速率[15]。雖然前人從萌發、生物量、呼吸代謝、光合特征，養分組成等方面對鹽脅迫下藜麥鹽害的響應已有系統研究，但開展這些研究工作主要集中在NaCl(中性鹽)單一因素處理下對藜麥生長的影響，把滲透脅迫和高濃度Na+毒害效應作為鹽脅迫的2個主要因素[16]，自然界的鹽堿成分復雜[17]，我國西北地區鹽堿地大多屬于復合型鹽堿地, 造成鹽堿的主要成分為NaHCO3和Na2CO3，兼有NaCl和Na2SO4，因此鹽化與堿化作用往往同時發生[18]，而以混合鹽堿脅迫處理展開的研究尚未見報道。種子萌發是植物生長的關鍵及敏感階段[19-20]，本研究從種子萌發及幼苗抗氧化酶特性探討藜麥的耐鹽堿性，揭示其耐鹽堿機制，旨在為藜麥在鹽堿地的適應性種植、農業系統多元化栽培及生態環境改善奠定良好的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

1.1.1實驗材料 供試藜麥由寧夏農林科學院科泰種業有限公司提供，原產地秘魯，種子產于寧夏固原市原州區中度鹽堿地區(地跨東經105°58′～106°30′，北緯35°34′～36°38′，海拔1470～2920 m，年降水量350～650 mm)，千粒重0.327 g，選取成熟飽滿、大小均勻及無病蟲害的種子用于萌發試驗。

1.1.2鹽堿條件的模擬 根據古麗內爾等[21]的研究稍做改動模擬鹽堿條件，選擇2種中性鹽(NaCl、Na2SO4)和2種堿性鹽(NaHCO3、NaCO3)，以堿性鹽所占比例遞增順序設置5個處理組，依次為A、B、C、D、E(表1)，設定的鹽處理濃度為50，100，150，200 mmol·L-1。用pH計(雷磁PHS-3C)檢測20種不同鹽堿混合液pH值。

表1 各處理鹽分組成、摩爾比及pHTable 1 Salts composition, molar ratio and pH of solutions for mixed salt- alkali treatment

1.1.3種子萌發試驗 本試驗于2017年10月-2018年1月在甘肅農業大學實驗教學中心植物生理實驗室進行。選擇飽滿、大小均勻的藜麥種子，用2% NaClO消毒10 min并用去離子水沖洗3～5次，置于墊有2層濾紙的培養皿(Φ=9 cm)中，每皿50粒，每處理重復3次。置于光照強度4000 lx，溫度25 ℃/15 ℃，光周期16 h/8 h(晝/夜)光照培養箱中培養，每天10:00更換處理液，保持處理液濃度一致。每24 h統計一次發芽數，第7 天取幼苗測定進行抗氧化酶活性及同工酶電泳。

1.2 測定指標及方法

1.2.1種子萌發指標 萌發以胚根長為種子長的2倍為標準，計算公式如下：

發芽率(germination percentage, GP)=(第7 天發芽種子數/測試種子數)×100%[22]
發芽勢(germination energy, GE)=(前3 d發芽種子數/種子總數)×100%[22]
發芽指數(germination index, GI)= ∑(Gt/Dt)[23]

式中：Dt為日發芽種子數，Gt為與Dt相應的每天的發芽種子數。

1.2.2抗氧化酶活性的測定 酶液提?。悍Q取不同處理的藜麥幼苗0.5 g置于研缽中，加入5 mL 50 mmol·L-1磷酸緩沖液(pH 7.8，內含1%聚乙烯吡咯烷酮)冰浴研磨至勻漿，轉入10 mL離心管，在4 ℃、10000 r·min-1條件下離心15 min，上清液即為酶液[24]。

超氧化物歧化酶(SOD)活性測定方法：采用NBT顯色法測定[25]；過氧化物酶(POD)活性測定方法：采用愈創木酚氧化法測定[24]；過氧化氫酶(CAT)活性測定方法：采用紫外吸收法測定[25]；谷光甘肽還原酶(GR)的測定參照Halliwell等[26]的方法。

1.2.3抗氧化酶同工酶電泳 采用垂直不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳。SOD同工酶分離膠質量分數為10%，POD和CAT同工酶分離膠質量分數為7.5%，GR同工酶分離膠質量分數為8%，濃縮膠質量分數均為3.75%。濃縮膠和分離膠分別在電壓80和200 V，電流30和45 mA條件下電泳，上樣量均為40 μL。當溴酚藍指示劑移至前沿時，停止電泳。

將SOD膠塊依次浸于2.45 mmol·L-1NBT(四唑氮藍)中暗染20 min，0.036 mmol·L-1(pH 7.8)PBS(磷酸緩沖液)緩沖液(內含28 mmol·L-1TEMED(四甲基乙二胺)，28 μmol·L-1核黃素)中暗染15 min，0.05 mol·L-1(pH 7.0)PBS緩沖液[內含0.1 mmol·L-1EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)]日光燈下染色20 min[27]。將POD膠塊放入聯苯胺醋酸染液中染色5～10 min[28]。將CAT膠片放入0.05% H2O2溶液中浸泡10 min，蒸餾水沖洗2～3次，再放入1%氯化高鐵和1%鐵氰化鉀(1∶1)混合液中染色5 min[27]。將GR膠塊放入0.25 mol·L-1(pH 7.8) Tris緩沖液[內含0.24 mmol·L-1MTT(噻唑藍)，0.34 mmol·L-12,6-二氯靛酚，0.4 mmol·L-1NADPH(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)， 3.6 mmol·L-1GSSG( 氧化型谷胱甘肽)]中暗染50 min[29]。

1.3 數據分析

利用Microsoft Excel 2010進行數據整理，SPSS 19.0統計軟件進行方差(Duncan)分析(P<0.05)，Image J及Photoshop軟件對同工酶圖譜進行分析。

2 結果與分析

2.1 鹽堿脅迫對藜麥種子萌發的影響

不同pH的鹽堿脅迫下藜麥種子的累積萌發率如圖1所示。在A、B、C、D、E 5個不同的鹽堿環境中，隨著鹽堿濃度的增加，各組的累積萌發率均呈下降趨勢。此外，由A至E，pH值隨堿性鹽所占比例增加而增大，累積萌發率受鹽組分的影響不大，E處理組pH值最大，但其累積萌發率變化趨勢與A處理組相似，大于B、D組，C組的累積萌發率最低。A、C、E處理組下，鹽濃度大于100 mmol·L-1時，累積萌發率分別顯著下降了25.41%、41.83%、36.04%。而D處理組在鹽濃度大于150 mmol·L-1時累積萌發率顯著下降。

圖1 不同pH鹽堿脅迫下藜麥種子累積萌發率Fig.1 Accumulative germination percentages of C. quinoa seeds in salt-alkali mixed stresses at different pH values A, pH=7.43. B, pH=8.81. C, pH=9.10. D, pH=9.64. E, pH=10.43.

如表2所示，不同鹽堿組合的5種鹽溶液處理均引起藜麥種子發芽率、發芽勢、發芽指數降低，相同鹽組分下，隨著鹽濃度的增加抑制作用增強。相同鹽濃度下，A、E處理組的發芽率顯著大于B、C、D處理組，且B、C、D處理組間發芽率無顯著差異(P<0.05)，當鹽濃度為200 mmol·L-1時，5處理組發芽率差異不顯著。在50 mmol·L-1鹽濃度下，A處理組與CK相比發芽勢為顯著降低，B、C、D、E處理組發芽勢顯著降低；隨著鹽濃度增加，A、D、E處理組間差異逐漸顯著，但B、C處理組間發芽勢無差異。藜麥種子發芽指數在50 mmol·L-1鹽濃度下各處理組變化趨勢與該濃度下發芽勢趨勢一致，當鹽濃度大于150 mmol·L-1時，A、E處理組無顯著差異。

表2 不同pH鹽堿處理對藜麥種子萌發的影響Table 2 Effects of different pH values of salt-alkali concentration on seed germination of quinoa

注：同列不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著。

Note: In the same column, values with different small letters mean significant difference atP<0.05 level.

2.2 鹽堿脅迫對藜麥種子萌發期SOD活性及其同工酶的影響

由圖2可知， A處理組在濃度為50 mmol·L-1時SOD活性最大，B處理組SOD活性隨著鹽堿濃度的升高呈先增高后降低趨勢，且在 100 mmol·L-1時SOD活性最大。C、D處理組SOD活性均低于CK，且隨著鹽堿濃度的增加SOD活性逐漸降低，當濃度為200 mmol·L-1時，C、D處理SOD活性比CK分別降低了25.53%和20.90%。E處理SOD活性均低于CK，且隨鹽堿濃度增加先增高后降低。由圖3可看出，藜麥SOD同工酶譜帶呈現2條。遷移率為0.753的P2酶帶在鹽堿脅迫后顏色加深，C、D、E處理出現P1酶帶，顏色較P2酶帶淺，說明其表達量較低。

圖2 鹽堿脅迫對藜麥種子萌發期SOD活性的影響Fig.2 Effects of complex saline-alkali stress on SOD activity in quinoa during germination period

圖3 鹽堿脅迫下藜麥種子萌發期SOD同工酶電泳圖譜的變化Fig.3 Changes of SOD isoenzyme profiles under complex saline-alkali stress treatments 泳道CK為蒸餾水處理；泳道A1～A4為NaCl∶Na2SO4=1∶1處理；泳道B1～B4為NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3=1∶2∶1處理；泳道C1～C4為NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3=1∶9∶9∶1處理；泳道D1～D4 為NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3=1∶1∶1∶1處理；泳道E1～E4為NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3=9∶1∶1∶9處理；數字1～4為50，100，150，200 mmol·L-1鹽堿濃度。下同。按相對遷移率由大到小排序為P1，P2。Lane CK for distilled water; Lane A1-A4 for NaCl∶Na2SO4=1∶1 treatment; Lane B1-B4 for NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3=1∶2∶1 treatment; Lane C1-C4 for NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3=1∶9∶9∶1 treatment; Lane D1-D2 for NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3=1∶1∶1∶1 treatment; Lane E1-E4 for NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3=9∶1∶1∶9 treatment. Number 1-4 represent for 50, 100, 150, 200 mmol·L-1 saline-alkali solution concentration. The same below. According to the relative mobility from big to small, the enzyme bands ranked as P1, P2.

2.3 鹽堿脅迫對藜麥種子萌發期POD活性及其同工酶的影響

由圖4所示，各混合鹽堿脅迫下POD活性在濃度為50 mmol·L-1時最大，除C處理。A、B、D、E處理POD活性分別比CK顯著增加了27.20%，49.85%，58.80%和72.00%(P<0.05)，C處理POD活性與CK相比降低了0.02%。當鹽堿濃度大于50 mmol·L-1時，POD活性顯著降低，150和200 mmol·L-1濃度下POD活性無顯著性差異。由圖5可知，不同鹽堿處理下POD同工酶譜帶存在明顯的差異，POD同工酶共檢測出7條酶帶。A1、B1、C1、D1、E1泳道POD同工酶表達量最高，與之對應POD活性也最大。A、B處理組POD酶帶數較多，出現P4酶帶。C、D、E處理組隨著濃度增加，酶帶表達量逐漸降低。

2.4 鹽堿脅迫對藜麥種子萌發期CAT活性及其同工酶的影響

由圖6可得，混合鹽堿脅迫下藜麥CAT活性隨著鹽堿濃度的增加而降低。當濃度為50 mmol·L-1時，A、B、C、D、E處理CAT活性較CK分別降低了27.46%，0.04%，39.32%，30.17%，26.10%。當濃度大于150 mmol·L-1時，B、C、D、E處理CAT活性與CK相比降低50%以上。由圖7可看出，共檢測到5條CAT同工酶條帶，與CK相比，A1、B1、C1、D1、E1處理酶帶表達增強，A2、A3、C2、C3、D2、D3、E2、E3處理酶帶表達被抑制。A2、A3、A4、B2處理下出現P3酶帶，E1處理出現P1酶帶。

圖4 鹽堿脅迫對藜麥種子萌發期POD活性的影響Fig.4 Effects of complex saline-alkali stress on POD activity in quinoa during germination period

圖5 鹽堿脅迫下藜麥種子萌發期POD同工酶電泳圖譜的變化Fig.5 Changes of POD isoenzyme profiles under complex saline-alkali stress treatments 按相對遷移率由大到小排序為P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7。According to the relative mobility from big to small, the enzyme bands ranked as P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7.

圖6 鹽堿脅迫對藜麥種子萌發期CAT活性的影響Fig.6 Effects of complex saline-alkali stress on CAT activity in quinoa during germination period

2.5 鹽堿脅迫對藜麥種子萌發期GR活性及其同工酶的影響

由圖8可以看出，各處理組GR活性均隨著鹽堿濃度的增加呈先升高后降低的變化趨勢。與CK相比，A、B處理組各濃度下GR活性均顯著高于CK(P<0.05)，A處理組在鹽堿濃度為50 mmol·L-1時活性最大，B處理組在鹽堿濃度為100 mmol·L-1時活性最大。C、D、E處理組在鹽堿濃度為50 mmol·L-1時GR活性最大，分別比CK提高了31.25%，19.58%和31.25%，鹽堿濃度為200 mmol·L-1時GR活性比CK分別降低了44.58%，23.00%和27.08%。從圖9可知，在種子萌發期檢測到3條GR同工酶條帶，遷移率分別為0.535，0.434和0.292。與CK相比， P2條帶在A1、B1、C1、D1、E1處理下表達均受到抑制。A、C處理組隨著鹽堿濃度的增加P1和P3酶帶的表達量增加，B、D、E處理組隨著鹽堿濃度的增加P1酶帶的表達受到抑制。結果說明低濃度的鹽堿脅迫能提高GR活性，堿性鹽含量的增加會引起GR活性降低。

圖8 鹽堿脅迫對藜麥種子萌發期GR活性的影響Fig.8 Effects of complex saline-alkali stress on GR activity in quinoa during germination period

圖9 鹽堿脅迫下藜麥種子萌發期GR同工酶電泳圖譜的變化Fig.9 Changes of GR isoenzyme profiles under complex saline-alkali stress treatments 按相對遷移率由大到小排序為P1，P2，P3。According to the relative mobility from big to small, the enzyme bands ranked as P1, P2, P3.

3 討論

3.1 鹽堿脅迫對藜麥種子萌發的影響

種子萌發是植物對鹽脅迫最敏感的時期，而生活在鹽漬環境中的植物是否能夠萌發出苗，是植株在鹽堿條件下生長發育的前提[30]。本研究發現，藜麥種子的累積萌發率，發芽率，發芽勢及發芽指數在同一鹽組分條件下，隨著鹽濃度的增高均降低；在鹽濃度相同條件下，藜麥種子的萌發率因鹽組分的不同表現出差異性。在本試驗中，Na2SO4和NaHCO3的含量對藜麥種子萌發影響較大，這與張勇等[31]對鹽堿脅迫紅芪(Hedysarumpolybotrys)種子萌發的研究結果不同，造成這一現象的可能原因是混合鹽堿脅迫下多離子共同作用與單鹽脅迫對種子萌發的調控機制不同。劉文瑜等[11]和楊宏偉等[12]研究表明，在小于300 mmol·L-1NaCl脅迫下藜麥種子的萌發率均達到65.36%，而本試驗中，當A處理組鹽濃度大于150 mmol·L-1，B、C、D、E處理組鹽濃度大于100 mmol·L-1時，藜麥種子的萌發率就會低于50%。這表明，混合鹽堿脅迫對藜麥種子萌發的影響比單鹽脅迫更嚴重。古麗內兒·亞森等[21]研究表明，灰綠藜種子萌發率隨pH值增加而減少，本研究發現，鹽濃度是決定藜麥種子萌發的主要因素，鹽組分對藜麥種子萌發影響次之，這可能是由于不同植物在種子階段適應自然生境的能力不同。

3.2 鹽堿脅迫對藜麥種子早期幼苗抗氧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GR)作為植物體內的活性氧(ROS)清除劑，在植物抗逆響應過程扮演重要的保護作用[32]。SOD作為膜保護的首道防線，它能清除超氧陰離子(O2-·)，轉變成氧化能力極強的羥自由基(·OH)[22]。本試驗中，A和B鹽組分下SOD活性無明顯變化，這可能由于藜麥對中性鹽具有一定耐受性，無須通過SOD活性提高降低氧化損傷；C、D和E鹽組分下SOD活性降低，說明堿性鹽條件下藜麥抗氧化酶系統中SOD不是主要抗氧化酶。SOD催化產生的H2O2會被POD和CAT轉化為H2O和O2[22]。本試驗結果表明，50 mmol·L-1鹽堿脅迫下POD活性高于CK，表明藜麥一定程度上可通過提高POD活性清除H2O2。隨著鹽濃度和堿性鹽比例增加，POD和CAT活性降低，降低原因可能是由于積累了大量ROS，使細胞膜結構及穩定性破壞進而影響正常代謝活動。當鹽濃度在大于100 mmol·L-1的相同鹽濃度下，CAT活性幾乎均高于POD活性，說明低濃度時主要依靠POD，高濃時依靠CAT和POD共同作用。GR是抗壞血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循環關鍵酶，在維持還原型谷胱甘肽高于氧化型谷胱甘肽含量方面有重要的作用，促進植物體內主要的抗氧化劑抗壞血酸(ASA)的再生[33-34]。在本試驗中，不同處理組GR活性不同，50 mmol·L-1的鹽濃度GR活性最高，隨著鹽濃度增加，GR活性先增加后降低。這與白健惠[35]鹽堿脅迫對燕麥(Avenasativa)生理特性影響的研究結果一致。

3.3 鹽堿脅迫對藜麥種子早期幼苗抗氧化酶同工酶表達的影響

同工酶是植物體內最活躍的酶之一，可通過酶譜直接判斷基因的存在及表達[36]。逆境常引起基因變異而使酶結構及其活性發生變化，而導致同工酶酶譜發生變化[37]。本試驗結果表明：鹽堿脅迫下藜麥種子萌發期SOD同工酶在鹽堿脅迫下表達增強，且隨著鹽濃度的增加呈增強的變化趨勢。多種因素會影響POD同工酶的表達，其編碼基因由一類超級基因家族的Px基因組成[38]。本試驗中，藜麥種子萌發期共呈現了7個POD同工酶位點，50 mmol·L-1鹽濃度迫后每個位點的表達活性增加，之后隨著鹽濃度的增加表達活性降低，但同工酶位點數增加。說明鹽堿脅迫下基因的表達受鹽濃度的影響，高濃度的鹽脅迫下藜麥種子萌發期部分基因轉錄、表達水平降低。這與孫靜等[39]的研究結果一致。CAT同工酶的表達與植物的脅迫適應能力有密切關系，藜麥種子萌發期CAT同工酶的表達與鹽濃度的關系與POD同工酶相似。前人的研究表明，GR同工酶的組成會受熱激[40]鹽[41]、干旱、鎘脅迫[42]的影響，本研究中大于100 mmol·L-1的鹽濃度脅迫下會誘導1個新的GR同工酶位點的表達。

4 結論

綜上所述，鹽濃度和鹽組分均抑制藜麥種子萌發，且鹽濃度的抑制效應大于鹽組分，堿性鹽的抑制作用強于中性鹽。GR為藜麥抵御鹽害的關鍵酶，50 mmol·L-1的鹽堿濃度下藜麥通過抗氧化酶活性的增加抵御鹽害，100～200 mmol·L-1鹽濃度下，POD和CAT活性顯著下降，說明50 mmol·L-1鹽堿濃度為藜麥的耐鹽堿閾值。