我國豬用病毒類生物制品質(zhì)量情況分析及建議

吳華偉，陳曉春，秦義嫻，高金源，李俊平，鄧永，曹明慧，高月異

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

我國作為世界上最大的生豬生產(chǎn)國和消費國，生豬產(chǎn)業(yè)體量巨大。據(jù)統(tǒng)計[1-2]，我國生豬養(yǎng)殖量約占世界生豬總養(yǎng)殖量的60%，豬肉消費量約占世界豬肉消費量的50%，豬肉在中國國內(nèi)肉類產(chǎn)量和消費量占比均超過60%，生豬飼養(yǎng)產(chǎn)值接近1.3萬億。隨著我國生豬養(yǎng)殖規(guī)模的日益擴大，豬病發(fā)生率也逐漸上升，呈現(xiàn)老病滅不盡，新病又發(fā)生的現(xiàn)狀，嚴重威脅養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。疫苗接種是預(yù)防和控制動物病毒性疾病最經(jīng)濟和最有效的手段，其質(zhì)量的好壞事關(guān)重大動物疫病防控成效和養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展，事關(guān)動物產(chǎn)品質(zhì)量安全和公共衛(wèi)生安全。本文對我國豬用病毒類生物制品現(xiàn)狀及2008-2017年豬用病毒類生物制品的質(zhì)量情況進行總結(jié)，分析存在的問題，提出做好豬用病毒類制品質(zhì)量控制的建議。

1 我國豬用病毒類生物制品基本現(xiàn)狀

1.1 主要種類 目前，我國豬用病毒類生物制品主要有4類：(1)疫苗類：包括活疫苗(傳統(tǒng)弱毒活疫苗和基因缺失活疫苗)、滅活疫苗(如全病毒滅活疫苗、亞單位疫苗、合成肽疫苗、基因缺失滅活疫苗等)以及細菌和病毒的聯(lián)苗。(2) 抗體類：包括卵黃抗體、高免血清、單克隆抗體類。(3) 診斷制品類：抗體檢測試劑或試劑盒(如ELISA試劑盒、瓊脂擴散抗原、HI抗原、乳膠凝集抗原等)以及抗原或核酸檢測試劑或試劑盒(如ELISA試劑盒、膠體金試紙條、PCR或RT-PCR試劑盒等)。(4)其他類：促性腺激素釋放因子類似物、干擾素、豬脾轉(zhuǎn)移因子等。

1.2 生產(chǎn)和銷售情況 據(jù)中國獸藥協(xié)會統(tǒng)計[3]，截至2017年年底，豬用生物制品共有有效文號515個，實際使用的391個，批準文號使用率為75.92%，其中豬用生物制品產(chǎn)品文號數(shù)量較多的產(chǎn)品為豬瘟活疫苗、偽狂犬活疫苗、仔豬副傷寒活疫苗、豬敗血性鏈球菌病活疫苗、仔豬大腸埃希氏菌病三價滅活疫苗和豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗。從銷售額看，豬用生物制品銷量為70.46億頭份/億毫升，總銷售為52.64億元，約占獸用生物制品總銷售額的39.39%；其中豬用強制性免疫疫苗銷售額為12.89億元，占所有強制性免疫疫苗銷售額的21.96%以及豬用生物制品總銷售額的24.49%，其中豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗、偽狂犬病活疫苗(Bartha-K61株)、豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗銷售額均超億元，總銷售額約12.21億元。

1.3 臨床試驗和新獸藥審批情況 從臨床試驗和新獸藥審批的情況看，近年來豬用生物制品研究已成為熱點。從臨床試驗批準的數(shù)據(jù)看(圖1)，2013年至2017年8月31日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部共批準臨床試驗376個，其中豬用生物制品164個，約占已批準臨床試驗的43%；批準的豬用生物制品臨床試驗中，豬用病毒類生物制品115個，約占豬用生物制品批準量的70%。從新獸藥審批的情況看(圖2)，2013-2017年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部共新批準各類獸用生物制品285個，其中豬用生物制品為52個，約占總批準品種的18%；批準的豬用生物制品中，豬用病毒類生物制品33個，約占豬用生物制品批準量的64%。

數(shù)據(jù)來源于中國獸藥信息網(wǎng)上國家獸藥基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫，2018年數(shù)據(jù)截至8月31日圖1 2013-2018年獸用生物制品臨床試驗批準件數(shù)Fig 1 The number of approved clinical trials of veterinary biologics from 2013 to 2018

數(shù)據(jù)來源于中國獸藥協(xié)會網(wǎng)站公布的行業(yè)統(tǒng)計數(shù)據(jù)圖2 2013-2017年新批準各類獸用生物制品數(shù)量統(tǒng)計Fig 2 The number of approved new veterinary biologics from 2013 to 2017

2 2008-2017年我國豬用病毒類生物制品質(zhì)量情況分析

為了解我國豬用病毒類制品的質(zhì)量情況，對2008-2017年中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(以下簡稱“中監(jiān)所”)承擔(dān)的所有類別(包括注冊檢驗、復(fù)核檢驗和監(jiān)督檢驗)的豬用病毒類生物制品檢驗情況進行了匯總，并對檢測出的不合格批次及檢驗項目進行了統(tǒng)計分析。

2.1 不合格批次及主要不合格項目情況 由圖3、圖4和圖5可知，2008-2017年，豬用病毒類制品共檢出不合格產(chǎn)品96批，年均不合格批數(shù)約為10批，不合格項目涉及外源病毒檢驗、支原體檢驗、效力(效價)檢驗、安全檢驗、敏感性檢驗、特異性檢驗、總蛋白含量測定、無菌檢驗、甲醛含量測定和剩余水分測定等10個參數(shù)，其中主要不合格項目集中在純凈性檢驗(外源病毒檢驗、支原體檢驗和無菌檢驗)、效力(效價)檢驗和安全檢驗三個方面，尤其以純凈性檢驗中的外源病毒檢驗和支原體檢驗項目為主要不合格項目。

圖3 2008-2017年豬用病毒類生物制品不合格批次逐年分布Fig 3 The annual distribution of unqualified swine virus biologics from 2008 to 2017

圖4 2008-2017年各類豬用病毒類生物制品不合格批次匯總情況Fig 4 The batches of different test parameters for unqualified swine virus biologics from 2008 to 2017

圖5 2008-2017年各類豬用病毒類生物制品不合格項目占比情況統(tǒng)計Fig 5 The percentage of different test parameters for unqualified swine virus biologics from 2008 to 2017

從不合格批次排名前4位的檢驗項目看，外源病毒檢驗31批、支原體檢驗19批、效力檢驗17批，安全檢驗7批，分別占所有不合格項目的比例為32.3%、19.8%、17.7%和7.3%，4項合計占所有不合格項目的比例為77%。從該4項主要不合格項目逐年分布情況看(圖6)，外源病毒檢驗不合格是目前各類檢驗最突出問題，其次為效力檢驗、支原體檢驗和安全檢驗。敏感性檢驗和特異性檢驗作為診斷試劑制品的主要質(zhì)量控制參數(shù)，2008-2017年共檢出不合格產(chǎn)品9批，約占所有不合格項目的9.4%；而總蛋白含量測定、無菌檢驗、甲醛含量測定和剩余水分測定等4個項目不合格批次基本一致，合計占所有不合格項目的比例為13.5%。

圖6 2008～2017年豬用病毒類生物制品主要不合格項目逐年分布情況Fig 6 The annual distribution of major unqualified parameters for unqualified swine virus biologics from 2008 to 2017

2.2 不合格風(fēng)險較高產(chǎn)品 從不合格批次排名前4位的項目對應(yīng)的具體產(chǎn)品情況看(表1)，各種病毒類活疫苗的外源病毒檢驗和支原體檢驗不合格的風(fēng)險均較高，效力檢驗不合格產(chǎn)品主要集中在批簽發(fā)數(shù)量較多且市場需要較大的豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗、豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗以及豬流性行腹瀉類疫苗，而安全檢驗不合格產(chǎn)品主要為偽狂犬病活疫苗豬和豬細小病毒病滅活疫苗。

表1 豬用病毒類生物制品主要不合格項目風(fēng)險較高產(chǎn)品Tab 1 The major risk products of unqualified parameters for swine virus biologics

2.3 不合格批次在各類檢驗中逐年分布情況 由圖7可以看出，2008-2009年不合格批次主要集中在監(jiān)督檢驗方面，2010年開始注冊檢驗不合格批次一直持續(xù)存在且處于較高水平(2012年、2015年和2017年均為當年不合格主要因素)，但從2014年開始文號復(fù)核試驗不合格批次持續(xù)存在并與注冊檢驗一并成為不合格批次的主要來源，而監(jiān)督檢驗不合格批次逐年減少，呈現(xiàn)較穩(wěn)定狀態(tài)。由此可見，目前新制品注冊檢驗和文號復(fù)核檢驗是豬用病毒類生物制品不合格批次的主要來源，提示必須加強新制品及文號復(fù)核樣品的質(zhì)量控制。

2.4 各類檢驗的主要質(zhì)量風(fēng)險點 從豬用病毒類生物制品不合格項目在各類檢驗中的分布情況看(圖8)，外源病毒檢驗和效力檢驗是各類檢驗都應(yīng)密切關(guān)注的主要質(zhì)量風(fēng)險點，支原體檢驗、效力檢驗、無菌檢驗、剩余水分檢驗和總蛋白測定(主要為口蹄疫滅活疫苗)是監(jiān)督檢驗需重點關(guān)注的質(zhì)量風(fēng)險點，安全檢驗、甲醛含量測定以及診斷試劑類的敏感性檢驗和特異性檢驗是注冊檢驗的主要質(zhì)量風(fēng)險點。需指出的是，外源病毒檢驗是豬用病毒類制品各類檢驗不合格的主要質(zhì)量風(fēng)險點，也是近幾年各類檢驗中暴露問題最集中的檢驗項，必要引起高度重視。

圖7 2008-2017年豬用病毒類生物制品不合格批次在各類檢驗中的逐年分布情況Fig 7 The annual distribution of unqualified items for swine virus biologics in various tests from 2008 to 2017

圖8 2008-2017年豬用病毒類生物制品不合格項目在各類檢驗中的分布Fig 8 The batches distribution of unqualified parameters for swine virus biologics in various tests from 2008 to 2017

3 關(guān)于做好豬用病毒類制品質(zhì)量控制的建議

3.1 以動物源性原輔材料質(zhì)量控制為重點，加強外源病毒檢驗 血清、胰酶、細胞、含有動物源性成分的培養(yǎng)基等原輔材料是獸用生物制品生產(chǎn)和檢驗中必不可少的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是造成制品外源病原污染的重要來源。如牛血清中經(jīng)常會污染BVDV、呼腸孤病毒，豬源胰酶中污染PCV1、PPV、TGEV等[4]。從近10年豬用病毒類生物制品檢驗結(jié)果看，外源病毒檢驗不合格是各類檢驗中存在的最突出問題，也是近年來檢驗不合格項目的主要風(fēng)險點。目前，我國獸用生物制品中常規(guī)外源污染(如BVDV、PPV、RHDV等)已得到充分重視，但對于原輔材料(如牛血清、胰酶、細胞、哺乳動物細胞用培養(yǎng)基等)的控制尚未引起足夠關(guān)注，存在較為嚴重的質(zhì)量風(fēng)險隱患。如2015版《中國獸藥典》僅制定了牛血清、生產(chǎn)用細胞(細胞系)的質(zhì)量標準，但缺乏使用量較大的胰酶、動物細胞用培養(yǎng)基以及檢驗用細胞的質(zhì)量標準，造成相關(guān)原輔材料控制無標準可依，或者企業(yè)制定的原輔材料內(nèi)控標準缺乏針對性，無法起到質(zhì)控目的。需要注意的是，檢驗用細胞作為外源病毒檢驗的最重要基質(zhì)，其質(zhì)量情況對檢驗結(jié)果也有直接影響。研究表明[5]，不同來源的相同細胞敏感性差異較大，如適應(yīng)PCV2培養(yǎng)的PK15必須經(jīng)特殊克隆篩選才能適應(yīng)病毒增殖。因此，采用不同來源的細胞進行外源病毒檢驗，也可能造成檢驗結(jié)果的差異。但《中國獸藥典》(2015年版)對檢驗用細胞尚無質(zhì)量標準，各企業(yè)在進行外源病毒檢驗時采用的細胞差異也較大，細胞的來源也不盡相同，甚至背景不清楚，且多數(shù)企業(yè)未對檢驗用細胞按規(guī)定進行系統(tǒng)鑒定、代次控制并建立種子批。因此，建議應(yīng)盡快制定完善胰酶、動物用細胞培養(yǎng)基以及檢驗用細胞質(zhì)量標準，并由中監(jiān)所統(tǒng)一制備并供應(yīng)外源病毒檢驗的細胞(如MDBK、ST、Vero細胞等)，并限定其代次使用范圍，以實現(xiàn)全行業(yè)檢驗結(jié)果的一致性，為提升獸用生物制品質(zhì)量提供可靠保障。

3.2 以獸用生物制品標準物質(zhì)研究為重點，夯實獸用生物制品檢驗物質(zhì)基礎(chǔ) 獸用生物制品標準物質(zhì)主要用于獸用生物制品效價、活性和含量等質(zhì)量檢驗或?qū)ζ涮匦澡b別、檢查或技術(shù)驗證。豬用病毒類生物制品的標準物質(zhì)主要有生產(chǎn)和檢驗用標準毒株(如生產(chǎn)用豬瘟兔化弱毒株以及檢驗用石門系豬瘟強毒株)、抗血清或單克隆抗體、參考疫苗(如PCV2參考疫苗)、抗原(如PPV HI抗原)以及診斷試劑(如PPV熒光抗體)等，其中特異性抗血清效價不高、特異性差是影響豬用病毒類活疫苗外源病毒檢驗和病毒含量測定(特別是對于多聯(lián)或多價活疫苗)結(jié)果以及造成檢驗結(jié)果不合格的主要因素。與先進國家相比，目前我國提供的非禽源標準抗血清和診斷用試劑種類還比較少，質(zhì)量參差不齊，且獸用生物制品行業(yè)使用的抗血清大都是多克隆抗體，單克隆抗體較少。這些日益成為制約我國獸用生物制品行業(yè)持續(xù)、健康發(fā)展的瓶頸，亟待進一步加大我國獸用標準物質(zhì)研制和引進力度，盡快解決困擾獸用生物制品行業(yè)的基礎(chǔ)性物質(zhì)短缺問題。建議應(yīng)進一步加強對新批準獸用生物制品相關(guān)標準物質(zhì)的審查力度，特別是加強對研制單位研制數(shù)據(jù)的核查機制，新制品審批時堅持制品申報資料與相應(yīng)標準物質(zhì)研制資料并重，復(fù)核檢驗時堅持對制品及相關(guān)標準物質(zhì)同時進行檢驗，強化制品研制單位將標準物質(zhì)足量指定保存與農(nóng)業(yè)農(nóng)村部新獸藥證書核發(fā)的關(guān)聯(lián)機制，并建立標準物質(zhì)強制換批要求及換批不及時的懲處機制，以確保新制品上市后檢驗時標準物質(zhì)的足量、有效供應(yīng)。同時，建議國家獸藥監(jiān)管部門牽頭，整合國內(nèi)研究和生產(chǎn)單位現(xiàn)有資源，以建立我國獸用生物制品檢測用單克隆抗體試劑庫為切入點，指定生產(chǎn)單位定點生產(chǎn)，由中監(jiān)所統(tǒng)一鑒定并對外供應(yīng)，實現(xiàn)資源和利益共享，并逐步建立和完善其他檢測用標準物質(zhì)的生產(chǎn)-供應(yīng)新模式[6]，不斷夯實獸用生物制品物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.3 以檢驗關(guān)鍵參數(shù)新技術(shù)和新方法研究為重點，提升獸用生物制品質(zhì)量檢測水平 近年來，各種檢驗新技術(shù)、新方法不斷涌現(xiàn)，獸用生物制品檢驗也理應(yīng)與時俱進，兼收并蓄。從2008-2017年豬用病毒類生物制品檢驗不合格項目看，外源病毒檢驗、支原體檢驗和效力檢驗是目前豬用病毒類生物制品的主要質(zhì)量風(fēng)險點，可以嘗試研究或引進新的檢驗技術(shù)或方法。

一是在外源病毒檢驗方面，可借鑒OIE國際貿(mào)易指定試驗或各國的農(nóng)業(yè)國家標準推薦的PCR方法作為現(xiàn)有檢驗方法的必要補充，特別是在取代傳統(tǒng)方法難以檢測或針對新出現(xiàn)的病原的檢測(如非洲豬瘟病毒)。目前，我國部分獸用生物制品已經(jīng)開始使用分子生物學(xué)方法(PCR或RT-PCR)作為非禽源外源病毒檢測的補充方法，如華中農(nóng)業(yè)大學(xué)和中牧實業(yè)股份有限公司的豬偽狂犬病活疫苗(HB-98株)采用PCR方法檢測鄂A野毒株污染，青島易邦生物工程有限公司的豬脾轉(zhuǎn)移因子注射液采用RT-PCR檢測口蹄疫病毒污染。

二是在支原體檢驗方面，目前獸用疫苗使用的細胞(細胞系)、生產(chǎn)種毒以及制品支原體污染現(xiàn)象較為嚴重，而《中國獸藥典》(2015版)對于支原體的檢驗規(guī)定的方法僅有培養(yǎng)法一種方法[7]，該種方法檢驗周期較長，易受抗生素影響，且不能檢出所有的支原體污染，亟需增加新的方法進行補充和完善。實驗室常用的支原體檢驗方法除培養(yǎng)法外，還有DNA熒光染色法、PCR方法、ElISA(抗原)檢測法、血清學(xué)方法、形態(tài)學(xué)檢查(電鏡檢查)等[8]，其中培養(yǎng)法和DNA熒光染色法也是美國9CFR、歐洲藥典和我國藥典普遍采用的方法。DNA熒光染色法具有可以檢測所有支原體污染且不受抗生素影響的優(yōu)點，PCR方法以其高敏感性、快速等特點被廣泛應(yīng)用于實驗室支原體檢驗的日常控制。三種支原體檢驗方法的比較見表2。建議參考美國9CFR、歐洲藥典和我國人藥典的相關(guān)標準，在目前《中國獸藥典》(2015版)培養(yǎng)法的基礎(chǔ)上，增加DNA熒光染色法作為法定方法之一，同時鼓勵企業(yè)在按照《中國獸藥典》規(guī)定的培養(yǎng)法方法進行支原體檢驗外，可在內(nèi)控標準中增加一些快速、通用的檢測方法，如DNA熒光染色法或PCR方法，將支原體控制的關(guān)口前移，防患于未然。

表2 三種支原體檢測方法的比較[11]

3.4 以制定通用的標準操作程序為重點，規(guī)范全行業(yè)獸用生物制品檢測 與國外獸用生物制品發(fā)達國家相比，目前我國的獸用生物制品檢驗尚缺乏全行業(yè)通用的標準操作程序，在具體檢驗過程中，對于一些共性的檢測項目(如無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗等)采用的細胞來源和代次、設(shè)備的型號和參數(shù)以及操作程序也各不相同，甚至是同一個產(chǎn)品的相同檢驗參數(shù)在不同的企業(yè)進行具體檢驗時檢測程序也不盡相同，不利于產(chǎn)品質(zhì)量的控制及檢驗結(jié)果的橫向比較。特別是在目前新建獸用疫苗企業(yè)已超過100家且有可能繼續(xù)增加的新形勢下，如何盡快提升行業(yè)從業(yè)人員的檢驗技術(shù)和能力，如何維持好來之不易的獸用生物制品較為穩(wěn)定的質(zhì)量形勢，是獸藥監(jiān)察系統(tǒng)必須面對和亟待破解的難題。近年來豬用病毒類生物制品檢驗結(jié)果也印證了此點，不合格產(chǎn)品和批次較多的企業(yè)絕大多數(shù)為新建企業(yè)，其不合格項目涵蓋了獸用生物制品檢驗的各個參數(shù)，甚至是無菌檢驗、支原體檢驗等常規(guī)檢驗項目。為此，可參照美國獸醫(yī)服務(wù)局規(guī)章第800.93號的做法，在中監(jiān)所目前制定的《獸用生物制品檢驗操作規(guī)程》基礎(chǔ)上，盡快編制我國獸用生物制品質(zhì)量檢驗標準操作規(guī)程，發(fā)布后印發(fā)全行業(yè)執(zhí)行，做到全行業(yè)一套標準檢驗程序，促進獸用生物制品檢驗工作的標準化、程序化、規(guī)范化。同時，可定期組織行業(yè)能力比對，及時向社會通報比對結(jié)果，并考慮將能力比對結(jié)果與行業(yè)日常監(jiān)管結(jié)合起來，促進生產(chǎn)企業(yè)自覺提高檢驗?zāi)芰退健?/p>