悶黃工藝因子對黃茶品質及滋味化學組分的影響研究

范方媛，楊曉蕾，龔淑英*，郭昊蔚，李春霖，錢虹，胡建平

1. 浙江大學茶葉研究所，浙江 杭州 310058；2. 浙江省德清縣農業局，浙江 德清 313200

黃茶是我國特有茶類之一，其特殊的悶黃工藝形成了“黃湯黃葉”，口感醇爽的典型特征。隨著消費需求多樣化趨勢的發展和人們對健康重視程度的提高，黃茶因其特殊的品質特征及抗氧化[1-2]、預防胃損傷[3]、抑制肝損傷[4-5]等保健功能而受到越來越多消費者的青睞，產銷量持續增長，黃茶產業日漸復蘇壯大。

黃茶傳統悶黃工藝中多采用趁熱堆積，利用在制葉余熱進行悶黃，必要時加蓋濕布，以保溫保濕，一段時間后開包散熱通氣，而后重復打包、散包，直至悶黃結束。已有研究顯示悶黃時間、悶黃葉含水率、悶黃溫度及悶黃通氧量是悶黃工序的關鍵因子[6-7]，其中根據悶黃在制葉含水率的不同分為“干坯悶黃”和“濕坯悶黃”兩大類，悶黃在制葉含水率分別為20%～25%和40%～50%，悶黃溫度“濕坯悶黃”溫度較高[6-9]，“干坯悶黃”溫度較低。悶黃溫度越高，濕熱反應越強，黃變速度越快，用時越短，反之時間延長[10]。王治會等[11]通過研究主要化學組分在悶黃過程中的反應動力學顯示，可通過控制悶黃過程中的含水率與溫度進而實現黃茶的快速悶黃。由此可見，悶黃工藝中在制葉含水率及悶黃溫度的高低決定悶黃時長，因此，相對于悶黃時間，在制葉含水率和溫度是悶黃工藝的關鍵工藝因子。本研究針對一芽一葉至一芽二葉初展的鮮葉原料，在傳統黃茶濕坯悶黃工藝參數基礎上，針對悶黃工藝葉溫、水分因素及通氣情況等因子開展工藝參數量化對比及優化，并結合化學計量學分析方法深入探究悶黃品質形成的化學機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、設備及試劑

試驗鮮葉原料取料及工藝試驗均在浙江省傳統黃茶產區德清縣莫干山茶區進行，采用3月底—4月上旬浙農113茶樹品種鮮葉，采摘標準為一芽一葉至一芽二葉初展。

加工及檢測設備儀器：黃茶加工采用滾筒殺青機、8CHFJ-5B型發酵機、6CRM-35型揉捻機、6CH-0.8型茶葉烘干機和 JY-6CHY-70型旋轉式烘焙提香機。檢測采用 DL-WS210溫濕度自動記錄儀、BSA124S-CW 型電子天平、SIGMA-3K15x型離心機、HWS28型恒溫水浴鍋、島津LC-10高效液相色譜儀。

主要試劑：對照標準品8種兒茶素單體、沒食子酸、9種黃酮苷單體、及 19種氨基酸單體，均購自于阿拉丁（上海）試劑公司，純度≥98%；色譜純甲醇、乙腈、乙酸、甲酸購于美國Tedia公司；分析純鄰苯二甲醛（OPA）、氯甲酸芴甲酯（FMOC）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）均購于國藥試劑集團。

1.2 試驗方法

黃茶加工：采用工藝試驗流程為：鮮葉→攤放→殺青→攤涼→（初烘）→悶黃→干燥，其中鮮葉自然攤放10 h（間接鼓風2～3 h）；滾筒殺青實際桶溫(200±10)℃，葉溫(100±10)℃，葉片過滾筒用時1.5 min，揉捻35 min；悶黃工藝中葉溫、在制葉含水率、悶黃環境相對濕度及通氣頻率等參數參見表1～表3。由于通氣頻率提高會減緩悶黃進程，因此悶黃時間需適當延長，本試驗中通氣頻率為每20 min 1次條件下悶黃時長5 h，通氣頻率為每10 min 1次條件下悶黃時長 8 h；干燥采用烘干機，葉溫80℃，烘干時長30 min。

感官審評：5名具有國家二級評茶員以上資質的茶葉審評專家組成審評小組，依據《茶葉感官審評方法》（GB/T 23776—2018）國家標準中規定的審評方法，采用3 g茶樣，150 mL沸水沖泡5 min，依次對茶葉外形、湯色、香氣、滋味及葉底共5項因子分別進行術語描述及評分，總分按照外形25%、湯色10%、香氣25%、滋味30%及葉底10%進行加權計算。

茶湯制備：采用醇提法[12]制備茶湯。稱取磨碎茶樣 0.15 g置于離心管，加入 25 mL 50%乙醇，于70℃水浴萃取30 min，期間每隔10 min搖動1次，浸提時間到后取出冷卻至室溫，于 4℃ 12 000 r·min-1離心 10 min，取上清液用于滋味化學組分分析。

兒茶素、沒食子酸及生物堿測定：采用HPLC-UV檢測法，色譜柱采用Agilent TC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相 A 為V乙腈∶V乙酸∶V水=6∶1∶193，流動相B為V乙腈∶V乙酸∶V水=60∶1∶139，洗脫梯度為：B相初始濃度 20%，35 min線性上升至 65%，隨后立即降至20%，保持5 min，至40 min時結束，流速 1 mL·min-1，柱溫 25℃，檢測波長 280 nm，進樣量 10 μL。

黃酮測定：采用HPLC-UV檢測法，色譜柱采用Agilent TC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相A為0.1%的甲酸水溶液，流動相B為0.1%的甲酸乙腈溶液；洗脫梯度為：B相初始濃度為 20%，55 min線性上升至50%，隨后立即降至20%，保持5 min，至60 min時結束，流速 1 mL·min-1，柱溫 35℃，檢測波長360 nm，進樣量 10 μL。

氨基酸測定：采用 HPLC-FLD檢測法。進樣檢測前進行OPA和FMOC柱前衍生，柱前衍生取 0.4 mol·L-1硼酸緩沖溶液（pH 為10.2）500 μL，OPA（10 mg·mL-1）50 μL，FMOC（1.5 mg·mL-1）50 μL，去離子水 300 μL，加入待測茶湯 5 μL，混勻立即進樣分析。HPLC-FLD 檢測采用色譜柱 Zorbax Eclipse-AAA 柱（4.6 mm×75 mm，3.5 μm），流動相A為40 mmol·L-1Na2HPO4（pH為7.8），流動相 B 為V乙腈∶V甲醇∶V水=45∶45∶10，洗脫梯度為：B相初始濃度為5%，18 min線性上升至60%，18～23 min線性上升至100%，隨后立即下降至 5%，保持 5 min，至 28 min時結束，流速1.5 mL·min-1，柱溫40℃；發射波長 340 min，激發波長 450 nm，進樣量 10 μL。

1.3 數據統計與分析

各處理均設置3次重復，采用Excel 2010進行數據分析處理，以平均值±標準差顯示最終數據；采用 IBM SPSS Statistics 21.0的ANOVA分析方法比較不同處理間樣品理化成分的差異；采用Unscrambler 9.7進行主成分分析（PCA）。

2 結果與分析

2.1 悶黃葉溫對黃茶品質及滋味成分的影響

已有研究顯示，傳統悶黃工藝堆溫一般控制在 35～45℃[8-9]，基于傳統工藝和實際生產現狀，本試驗研究了不同悶黃葉溫度對黃茶品質的影響，感官分析顯示（表1，樣品1、2），悶黃過程中葉溫較低[(35±2)℃]，形成的黃茶外形色澤、湯色及葉底色澤均偏嫩綠，香氣微生，滋味表現略澀（樣品 1），即使悶黃在制葉含水率降低能夠提高樣品滋味鮮爽度（樣品2），但感官特征仍偏綠茶風格。悶黃葉溫度在(45±2)℃時，形成的黃茶樣品（樣品3）黃茶風格較顯，外形色澤嫩黃，香氣呈甜香，滋味鮮爽。由此可見，提高悶黃葉溫有助于黃茶風格的形成，滋味澀感明顯減弱。已有研究顯示酯型兒茶素和生物堿是滋味苦澀感的重要貢獻物質[13-15]；而升高溫度能夠促進水溶液中酯型兒茶素的水解反應及異構化反應的進行[16]，其中酯型兒茶素EGCG和ECG與黃茶的黃變程度相關性較大，溫度越高，EGCG和 ECG的降解越快[11]。不同悶黃葉溫下黃茶樣品滋味化學組分含量結果（表2，樣品1、3）顯示，悶黃葉溫的提高有利于降低樣品中酯型兒茶素（EGCG、ECG）的含量，同時顯著提高非酯型兒茶素（C、GC、EC、EGC）的含量。

2.2 悶黃水分對黃茶品質及滋味成分的影響

悶黃中的水分因素包括在制葉含水率及悶黃環境相對濕度兩個方面。在制葉含水率與悶黃過程中的濕熱作用直接相關，在傳統“濕坯悶黃”參數基礎上，本研究采用初烘工序控制悶黃在制葉含水率，經初烘后的在制葉含水率較低，為(37±3)%；未經初烘處理的在制葉含水率較高，為(50±2)%。經相同的悶黃工藝處理后，感官對比結果顯示（表1，樣品1、2，樣品 4、5，樣品 6、7，樣品 8、9），較高的在制葉含水率使黃茶香氣和滋味中易出現熟悶感，較低的含水率進行悶黃處理能夠提高黃茶香氣的高爽及馥郁程度，同時能夠提高滋味的甘爽度和醇爽度。滋味組分含量對比顯示（表 3，樣品 1、2，樣品 4、5，樣品 6、7，樣品8、9），本研究條件下降低悶黃在制葉含水率明顯提升樣品兒茶素組分中 EGCG的含量，同時降低GA和部分氨基酸組分含量，尤其在通氣頻率較低時，氨基酸組分中 Asp、Glu、Gln、Val、Phe、Ile及 Leu等含量有明顯降低。

傳統悶黃工藝中，悶堆表面必要時需加蓋濕布，以保溫保濕[6]，表明悶黃過程需要一定的環境相對濕度，以維持悶黃在制葉的含水率。本研究采用機器調控量化悶黃環境相對濕度參數，樣品感官對比（表1，樣品3、4，樣品 6、8，樣品7、9）顯示，提高悶黃環境相對濕度能夠加速黃變進程，加深樣品色澤中黃色程度。若在制葉含水率較高[(50±2)%；樣品 3、4，樣品 6、8)]，提高悶黃環境相對濕度易使感官香氣滋味出現熟悶感；而在制葉含水率較低時[(37±3)%；樣品7、9]，提高悶黃環境相對濕度則有助于提升香氣的甜香及感官滋味的醇厚度和甘潤度。滋味化學組分含量對比顯示（表2與表3，樣品3、4，樣品6、8，樣品 7、9），提高悶黃環境相對濕度可明顯提高樣品中 GA、Glu含量，同時明顯降低EC含量。

2.3 通氣頻率對黃茶品質及滋味成分的影響

悶黃過程離不開通氣，傳統悶黃工藝中的多次翻堆、散包等方法即是通過翻動悶黃葉堆，使葉堆中心降溫通氣，防止濕熱作用過度。本研究通過控制悶黃設施的通氣間隔時長進而改變通氣頻率。感官品質比較顯示（表1，樣品 4&6，5&7），相同悶黃溫濕度及較高在制葉含水率條件下，通氣頻率較低（每20 min換氣1次），形成的黃茶產品香氣滋味中有熟悶味；提高通氣頻率（每10 min換氣1次）使得香氣高略帶甜香，滋味較甘醇，黃茶品質明顯提升。相同悶黃溫濕度及較低在制葉含水率條件下，較低的通氣頻率形成的黃茶風格特征較明顯，但香氣滋味表現一般；而較高通氣頻率形成的黃茶香氣及滋味的甘醇感表現較優，但干茶色澤稍偏綠，滋味微澀，表明該條件下悶黃程度略偏輕。本研究基于提高通氣頻率原則，設通氣頻率每10 min 1次，將悶黃環境濕度進一步提升至(80±5)%，結果顯示在制葉溫度(45±2)℃、含水率(37±3)%條件下制得的黃茶呈現典型“黃湯黃葉”風格特征，香氣高爽略甜，滋味甘潤醇厚，感官審評各因子及總分相對較高，均達94分及以上。由此可見，通氣頻率與悶黃溫度、水分因素協同作用調控黃茶品質，尤其對滋味甘醇度、醇厚度及澀感方面影響顯著，與已有研究結論一致[17]。楊涵雨等[17]對比充氧悶黃及充氮悶黃，發現充氧悶黃可顯著提高滋味組分中氨基酸、EC等含量，同時顯著降低酯型兒茶素和咖啡堿含量。而本研究中（表2和表3，樣品4&6，5&7）高通氣頻率（每10 min 1次）下，黃茶樣品中GA、EC及氨基酸組分Asn、茶氨酸、Phe的含量相對較低；而兒茶素組分EGC、C、酯型兒茶素（EGCG、GCG、ECG、CG）、咖啡堿及氨基酸組分Gln、Ser、Ala的含量相對較高；推測變化趨勢差異是由于悶黃處理方式及相關其他工藝參數差異導致。同時，雖然提高通氣頻率使得樣品中某些澀感物質含量較高，某些氨基酸組分含量較低，但該處理明顯提升了黃茶滋味品質，表明滋味感官的優劣不能僅僅以部分滋味屬性特征組分的含量為質量評價的全部依據。

表1 不同處理加工形成的黃茶的感官品質分析結果Table 1Sensory evaluation of yellow tea under different yellowing-processing parameters

表2 不同處理加工形成的黃茶沒食子酸、兒茶素類、生物堿類及黃酮糖苷類組分含量表Table 2Contents of gallic acid,catechins,alkaloids andflavone glycosides in yellow teas under different yellowing-processing parameters

表3 不同處理加工形成的黃茶中主要氨基酸組分含量表Table 3Contents of aminoacids in yellow teas under different yellowing-processing parameters

2.4 不同悶黃處理的黃茶感官品質風味特征分析

不同悶黃工藝黃茶感官品質特征風味輪如圖1-a所示，樣品品質特征差異體現在色澤（包括干茶、湯色、葉底）、香氣和滋味特征方面，其中悶黃程度偏輕的黃茶表現出色澤偏綠，香氣偏清鮮且滋味略澀，總體風格偏綠茶。在黃茶風格明顯的前提下，干茶外形色澤以黃色為主，略帶綠或褐；湯色嫩黃、杏黃或黃；香氣表現出高爽、甜香或花香的特征香型，以及生青、熟悶的缺陷香型；滋味表現出甘、鮮、醇、厚的特征味感，以及熟悶的缺陷味感。其中，生青主要由殺青不足導致，而悶黃過度容易導致熟悶。

本試驗條件下黃茶滋味特征受悶黃工藝因子影響，其變化如圖1-b和1-c所示，悶黃葉溫、相對濕度及在制葉含水率過低，易形成悶黃程度偏輕，滋味偏清鮮的偏綠茶風格（樣品1、2、3、7）。隨悶黃葉溫、在制葉含水率及環境相對濕度的提升，悶黃程度加深，黃茶風格明顯，滋味的甘潤度及醇厚度顯著提升，但在制葉含水率較高易導致黃茶出現熟悶味（樣品4、8），為了避免熟悶味的形成，需要采用較低的在制葉含水率配合相對較高的悶黃環境濕度進行處理。此外，提升通氣頻率能夠顯著提升黃茶滋味中的甘醇度（樣品6、7、8、9），但通氣頻率的提高必然引發悶黃進程的延遲，為了提高效率，需要進一步優化悶黃環境的相對濕度。綜上，本試驗條件下悶黃最優工藝參數為悶黃葉溫(45±2)℃、在制葉含水率(37±3)%、環境相對濕度(80±5)%、及通氣頻率為每10 min 1次，以此參數進行悶黃處理，形成的黃茶風格特征明顯，內質滋味甘潤、醇厚。

2.5 悶黃工藝參數對黃茶品質形成及主要滋味化學組分變化的貢獻分析

為了進一步探究悶黃工藝因素對黃茶滋味品質的影響，本研究進一步基于主成分分析重點解析悶黃工藝中葉溫、環境相對濕度、在制葉含水率及通氣頻率對黃茶主要滋味品質成分的影響。主成分分析顯示，經降維處理后提取主成分1和主成分2的積累方差貢獻率為74%，其中主成分1為56%，主成分2為18%。如圖2-a所示，不同悶黃處理的黃茶樣品在主成分1上明顯的分為2類，其中樣品1、2、3、4、5聚為一類，分布在第二象限和第三象限內；樣品 6、7、8、9聚為一類，分布于第一象限和第四象限內，表明兩組樣品之間有顯著差異。分析發現，樣品1、2、3、4、5的悶黃通氣頻率均為每20 min 1次，而樣品6、7、8、9的悶黃通氣頻率均為每10 min 1次，推測本試驗條件下通氣頻率是區分兩類樣品的關鍵工藝因子。相關性載荷散點圖（圖2-b）顯示，4個悶黃工藝因子中，通氣頻率在主成分1上相關系數接近 1.0，表明在樣品分類方面有重要貢獻度，其次是悶黃環境的相對濕度。由此可見，本試驗條件下相對于悶黃葉溫和在制葉含水率，通氣頻率和悶黃環境相對濕度對黃茶悶黃質量影響較大。

圖1 不同悶黃工藝因子處理形成的黃茶品質特征風味輪（a）及黃茶滋味特征受工藝因子影響的趨勢變化（b和c）Fig. 1 Flavor wheel of yellow tea (a) and the changes of yellow tea taste-characteristic intensity (b and c) under different yellowing-processing parameters

相關性載荷圖顯示，本試驗條件下含量較高的EGCG（圖2-b中的8）與4個工藝因子相距較遠，雖然 EGCG在不同悶黃工藝參數的作用下其含量部分有規律性變化，但因其含量相對較高，增加或減少的比例相對較小，綜合分析顯示本研究中基于相同原料基礎，EGCG受悶黃工藝中4個主要因子的影響相對較小，而由此推測該條件下悶黃工藝因子對感官滋味的影響主要通過調控微量組分而實現。圖2-b顯示，黃茶滋味品質組分中，EC、茶氨酸、Asn、Ile、TP、Phe及Asp受通氣頻率影響較大。楊涵雨等[17]對比不同供氧量下悶黃處理也顯示充氧悶黃對 EC、氨基酸含量有顯著影響，但含量變化趨勢與本研究中不完全一致，推測因試驗條件中其他工藝參數的差異而導致。本研究中兒茶素組分中CG、ECG、GCG及EGC，主要黃酮組分Myr-rha、Que-gal，以及氨基酸組分 Ser、Arg、His、GABA、Ala和Gln，與悶黃過程中環境相對濕度的相關性較高；但其含量的變化同時受到在制葉含水率及通氣頻率等因素的影響。此外，氨基酸組分中 Thr、Val、Trp、Glu和 GA則受悶黃在制葉含水率的影響較大，其中GA是酯型兒茶素的主要水解產物。由此看出，原料一致條件下，悶黃水分因素對多酚類化合物的影響較大。陳玲等[8]研究顯示影響茶多酚含量因素的因子順序為：含水率>悶黃溫度>悶黃時間，與本研究結論一致。圖2-b中與悶黃葉溫相關性較高的滋味化學組分表現不突出，推測一方面由于本研究中溫度優化試驗基于傳統工藝溫度參數在一定的適宜溫度范圍內進行，受溫度調控的組分未表現出較大波動；另一方面說明在相同原料基礎下，一定溫度范圍內，水分、通氣等悶黃工藝因子對滋味組分的影響更顯著。

3 討論

本研究顯示在傳統工藝悶黃溫度范圍內，相對較高的悶黃葉溫度利于黃茶品質的形成。悶黃過程實質是非酶促濕熱化學變化，其中“濕”是化學變化的必要條件，本研究顯示一定在制葉含水率范圍內，悶黃環境相對濕度對品質的形成有著非常重要的作用，相同悶黃葉溫下適當提高悶黃環境的相對濕度不僅能夠加速黃變，同時還可提升黃茶滋味的厚度；在此基礎上配合較低的在制葉含水率形成的黃茶品質較優，尤其是滋味的甘潤度及醇厚度明顯提升。同時本試驗條件下通氣狀況是黃茶悶黃工藝中最為重要的工藝因子，通氣頻率提升，明顯改善黃茶熟悶味，明顯提升滋味的甘潤感。綜上，本研究在原料基礎一致的前提下，悶黃在制葉溫度(45±2)℃、在制葉含水率(37±3)%、環境相對濕度(80±5)%、通氣頻率為每10 min 1次，以此參數進行悶黃處理，形成的黃茶風格特征明顯，內質滋味甘潤、醇厚。

圖2 不同悶黃工藝處理的樣品主成分分析得分圖（a）及因子相關性載荷散點圖（b）Fig. 2 Principal Component Analysis (PCA) scores of yellow tea samples under different yellowing-processing parameters (a) and Correlation Loadings of taste-chemical constituents and yellowing process factors (b).

主成分分析顯示本試驗中黃茶滋味品質化學組分 EC、茶氨酸、Asn等受悶黃通氣頻率影響較大；多種兒茶素組分（CG、ECG、GCG 等），主要黃酮組分 Myr-rha、Que-gal以及多種氨基酸組分（Ser、Gln、Arg、His、GABA）與悶黃環境相對濕度的相關性較高；在制葉含水率對 GA含量的影響較大；而EGCG和咖啡堿受悶黃工藝因子的影響不大。部分滋味組分的含量的變化規律與前期研究中表現并不完全一致，推測一方面由于品種差異和悶黃處理方式不同。此外，有研究顯示雖然多酚氧化酶等酶類在殺青之后大幅下降，但隨著悶黃過程的深入，多酚氧化酶、過氧化氫酶和纖維素酶活性顯著增加至一定程度后，隨后逐步減少[18]，推測悶黃過程中濕熱作用連同殘余酶類共同促進了多酚類化合物的氧化，形成了茶黃素等氧化產物[17-18]，而茶黃素以及茶黃素-咖啡堿絡合物等對茶湯滋味強度、鮮爽度等感官屬性具有貢獻[19-20]，推測氧化及絡合產物在黃茶品質方面可能也起到了一定的作用。綜上表明，滋味特征是所有已知及未知的化學組分共同表達的結果，不能僅以單個或幾個組分的含量變化來衡量，進一步研究需要對工藝因子引起的組分比例變化及氧化物質進行深入探索。